家蠶和黃粉蟲酪氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)性質(zhì)和功能的研究.pdf

1、黑化反應(yīng)是酚類物質(zhì)通過氧化還原生成醌類物質(zhì)和色素的反應(yīng)過程。黑化反應(yīng)的第一步是酪氨酸羥基化生成3，4-二羥基苯丙氨酸（多巴），然后多巴在多酚氧化酶等一系列酶的作用下形成黑色素。酪氨酸羥化酶(TH)和多酚氧化酶(PO)都可催化酪氨酸形成多巴。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是一種以酪氨酸為底物，鐵離子和四氫生物喋呤為輔因子，催化氧化酪氨酸形成多巴的芳香族氨基酸羥化酶。酪氨酸羥化酶廣泛存在于昆蟲、哺乳動物和人類

2、中，是新陳代謝不可或缺的酶類。已有大量研究表明，PO具有催化酪氨酸羥化成多巴的單酚加氧酶（簡稱酪氨酸酶）活性，又具有催化多酚類物質(zhì)氧化的雙重功能，PO在昆蟲表皮硬化、色素形成、傷口愈合以及抵御病原微生物的侵染等過程起著重要的作用。過去較多的研究集中于酚氧化酶，鑒于TH和PO都具有催化酪氨酸形成多巴的能力，因此研究TH的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和在昆蟲體內(nèi)的生理功能具有十分重要的意義。
　　 本研究以黃粉蟲和家蠶為材料，克隆黃粉蟲（Tenebri

3、o molitor）酪氨酸羥化酶基因（TmTH）和家蠶（Bombyx mori）酪氨酸羥化酶基因(BmTH)的開放閱讀框架，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達(dá)重組蛋白，親和層析純化目的蛋白;分離純化黃粉蟲血淋巴多酚氧化酶(PO)，測定重組TmTH、體內(nèi)TmTH和PO活性和動力學(xué)參數(shù)。比較TmTH和PO對酪氨酸的催化效率;用酪氨酸羥化酶抑制劑進(jìn)行了TmTH對表皮色素形成、硬化和血淋巴黑化及其發(fā)育變態(tài)中的影響。同時構(gòu)建

4、BmTH的突變體，親和層析純化野生型和突變體重組蛋白，測定它們的內(nèi)源熒光光譜、活性和動力學(xué)參數(shù)。分離純化家蠶表皮多酚氧化酶，測定活性和動力學(xué)參數(shù)，比較了BmTH和PO對酪氨酸的催化效率。
　　 結(jié)果表明，克隆的黃粉蟲TmTH和家蠶BmTH都屬于黑腹果蠅酪氨酸羥化酶typeⅡ型，N-端含有一段富含酸性氨基酸的調(diào)節(jié)區(qū)，C-端含有保守的芳香族氨基酸羥化酶催化區(qū)。重組TmTH和體內(nèi)TmTH的動力學(xué)參數(shù)沒有明顯差異，可以用重組TmTH代替

5、天然TmTH進(jìn)行相關(guān)的研究。黃粉蟲TmTH的催化效率與PO相比，對酪氨酸的親和力比PO低，催化效率比PO低很多。TmTH活性降低使血淋巴黑化程度下降，培養(yǎng)的表皮組織色素沉著減弱，黃粉蟲發(fā)育和變態(tài)異常。BmTH<中文標(biāo)題>=催化區(qū)氨基酸AA419天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼嵬蛔凅w和N-瑞的調(diào)節(jié)區(qū)缺失突變體使活性下降，三維結(jié)構(gòu)變化，重組BmTH的催化效率與PO相比，對酪氨酸的親和力差別不顯著，但催化效率比PO低。綜上所述，昆蟲TH的結(jié)構(gòu)性質(zhì)與哺乳動