黃粉蟲(chóng)酪氨酸羥化酶原核表達(dá)、活性測(cè)定及其在黑化過(guò)程中的作用.pdf

1、黑化反應(yīng)在昆蟲(chóng)的表皮鞣化、色素形成以及免疫防御過(guò)程中起著重要的作用。黑化反應(yīng)是酪氨酸在酶的作用下首先羥化為3,4-二羥苯丙氨酸(DOPA),然后DOPA再在相關(guān)酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為兒茶酚類及其衍生物,最終形成色素的過(guò)程。酪氨酸羥化成多巴的反應(yīng)是黑化反應(yīng)的限速步驟,可在兩種酶的作用下進(jìn)行:酚氧化酶(phenoloxidase,PO,EC1.14.18.1)和酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH,EC1.14.16.

2、2)。其中PO廣泛存在于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、蜚蠊目和直翅目等昆蟲(chóng)的各個(gè)發(fā)育期,且對(duì)其研究較為深入。而對(duì)昆蟲(chóng)TH的研究則主要集中在雙翅目及鱗翅目類昆蟲(chóng),尤以黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)研究最深入,對(duì)鞘翅目昆蟲(chóng)TH基因及其功能研究極少。對(duì)鞘翅目昆蟲(chóng)TH基因及其功能研究較少。
　　 本研究以鞘翅目昆蟲(chóng)黃粉蟲(chóng)(Tenebrio molitor)為研究對(duì)象,成功構(gòu)建黃粉蟲(chóng)酪氨酸羥化酶(TmTH)基因的原核

3、表達(dá)載體,并表達(dá)出有活性的酶蛋白,利用高效液相色譜法測(cè)定產(chǎn)物DOPA的含量,通過(guò)抑制TH酶活性,以PO作為參照,初步探討TmTH在黃粉蟲(chóng)黑化過(guò)程中的生理功能。為進(jìn)一步研究鞘翅目昆蟲(chóng)的表皮形成機(jī)理及免疫黑化打下基礎(chǔ),同時(shí)也為研究昆蟲(chóng)病蟲(chóng)害防治提供理論依據(jù)。主要內(nèi)容及結(jié)果包括：⑴黃粉蟲(chóng)酪氨酸羥化酶基因表達(dá)載體構(gòu)建與原核表達(dá)：將TmTH編碼區(qū)克隆到表達(dá)載體pET28a(+)中,并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了IPTG誘導(dǎo)濃度表達(dá)及誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá),結(jié)

4、果表明1mM IPTG誘導(dǎo)菌體表達(dá)5h時(shí),表達(dá)出的蛋白量最大。經(jīng)SDS-PAGE分析以及western-blot分析顯示誘導(dǎo)表達(dá)出活性蛋白的大小約為62 kD,這為進(jìn)一步研究TmTH體外酶學(xué)性質(zhì)及相關(guān)功能等方面的研究提供材料。⑵高效液相色譜法測(cè)定產(chǎn)物多巴的含量：將原核表達(dá)出的活性TmTH以及黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)不同組織提取物的TmTH樣品,在TmTH催化反應(yīng)體系中反應(yīng)10min,用高氯酸終止酶反應(yīng),應(yīng)用高效液相色譜紫外檢測(cè)法測(cè)定反應(yīng)生成的L-DO

5、PA含量,計(jì)算酶的活性。結(jié)果表明3ml原核表達(dá)菌體酶的比活性為10.028 U/mg,TH抑制劑3-碘-L-酪氨酸(3-iodo-tyrosine,3IL)明顯抑制了產(chǎn)物L(fēng)—DOPA的生成。⑶抑制酪氨酸羥化酶活性對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)血淋巴黑化及凝集功能的影響：幼蟲(chóng)血淋巴與不同濃度的PO抑制劑PTU及TH抑制劑3IL混合反應(yīng),室溫下拍照并記錄血淋巴的黑化時(shí)間變化,同時(shí)利用倒置顯微鏡拍攝黑化前后的血淋巴凝集狀況。結(jié)果表明3IL和PTU均有不同程度的

6、抑制作用,且抑制效果隨著抑制劑濃度增大而越明顯,其中3IL處理的血淋巴,其黑化時(shí)間稍微延長(zhǎng),且凝集塊明顯減少。⑷抑制體內(nèi)酩氨酸羥化酶活性對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)表皮黑化反應(yīng)的影響：配制含有不同抑制劑濃度的生理液注射不同發(fā)育體色的黃粉蟲(chóng)末齡幼蟲(chóng),觀察記錄注射創(chuàng)口的黑化時(shí)間。選取白色幼蟲(chóng)進(jìn)行注射,并記錄其白色表皮發(fā)育為黃褐色表皮的時(shí)間。剝離的白色幼蟲(chóng)表皮組織在不同條件下培養(yǎng),進(jìn)一步研究TmTH在表皮黑化過(guò)程中作用,48h后倒置顯微鏡下觀察表皮顏色變化。