賴氨酸羥化酶PLOD2在乏氧誘導膠質瘤遷移與侵襲過程中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM，WHOⅣ級)是人類中樞系統(tǒng)最常見、惡性程度最高的原發(fā)性腫瘤。目前，即便在顯微神經外科手術和藥物治療方面取得長足發(fā)展，但總體療效收效甚微，膠質母細胞瘤患者的平均中位生存期僅為14個月。腫瘤細胞向周圍腦實質呈浸潤侵襲性生長是手術很難將其完全切除的主要原因，同時，目前也認為這種侵襲特性是對多種綜合治療方案產生抵抗的主要因素之一。然而，膠質母細胞瘤的侵襲

2、相關分子機制至今尚未闡釋清晰，因此，進一步完善侵襲相關機制的研究，對改善腫瘤治療及患者預后都將有非常重要的臨床意義。
　　為了更深入地了解膠質母細胞瘤的侵襲相關機制，除了研究腫瘤細胞自身的特性外，還需要關注獨特而又復雜的腫瘤微環(huán)境。乏氧是腫瘤微環(huán)境的顯著特征之一，近年來受到越來越多的關注。目前認為乏氧與腫瘤的增殖、發(fā)生發(fā)展以及傳統(tǒng)治療的抵抗密切相關。乏氧可以阻止乏氧誘導因子-1α/2α(Hypoxia-inducible fact

3、or-1/2α，HiF-1/2α)的降解，病理狀態(tài)下HiF-1/2α可同持續(xù)激活的亞單位HiF-1β形成二聚體，特異性結合到基因上游乏氧調控元件上，激活相關基因的表達。因此，探究乏氧如何調節(jié)特定蛋白參與腫瘤侵襲的相關機制將有助于新的腫瘤治療策略的研發(fā)。
　　細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)重塑是腫瘤微環(huán)境的又一典型特征。在腫瘤進展過程中，瘤周常常出現(xiàn)大量的膠原蛋白沉積與交聯(lián)，進而導致細胞外基質硬度增加

4、。目前已證實，它可以促進腫瘤的浸潤和遠處轉移。已有的報道指出，包括膠質瘤在內的多種實體瘤的細胞外基質均存在硬度增加的改變。另外，細胞外基質的主要成分——膠原纖維也與膠質母細胞瘤的血管生成以及細胞黏附密切相關。膠原纖維交聯(lián)的形成需要賴氨酸羥化酶2(Procollagen-Lysine2-Oxoglutarate5-Dioxygenase2，PLOD2)的翻譯后修飾。依據功能不同，賴氨酸羥化酶可以分為三種不同的亞型——PLOD1、PLOD2

5、、PLOD3。賴氨酸羥化酶PLOD1特異性結合到膠原纖維α螺旋及中央區(qū)域，羥化修飾該區(qū)域的賴氨酸殘基，PLOD2特異性羥化端肽區(qū)域中的賴氨酸殘基，而PLOD3的催化底物尚不清楚。但在膠原交聯(lián)形成過程中，尤以端肽區(qū)域內的羥基化賴氨酸最為重要。在纖維性疾病中，膠原纖維的過度沉積主要是由于端肽的過度羥化及羥化賴氨酸殘基形成的吡啶啉交聯(lián)數目增加引起的。這種吡啶啉交聯(lián)物理性質更加穩(wěn)定，難以降解，而PLOD2是形成這種交聯(lián)的關鍵催化酶。目前，PLO

6、D2相關作用的研究在某些纖維性疾病如Bruck Syndrome、Ehlers-Danlos Syndrome VIA中已經報道。但PLOD2在膠質瘤中的作用尚不明確，目前僅有組織學表達分析發(fā)現(xiàn)，賴氨酸羥化酶PLOD2可以作為膠質母細胞瘤的一個新型生物學標志物。
　　本課題擬在前期研究基礎上，通過借助公共數據庫大數據分析、臨床膠質瘤標本收集以及免疫組化、天狼星紅染色、ELISA、慢病毒感染、RNA干擾、裸鼠原位腫瘤種植等相關分子生

7、物學技術，分別從患者病理資料信息及分子生物水平探討賴氨酸羥化酶PLOD2在膠質母細胞瘤中的作用及相關機制。
　　第一部分賴氨酸羥化酶PLOD2在膠質瘤組織中的表達情況
　　目的:
　　明確賴氨酸羥化酶PLOD2在膠質瘤組織中的表達情況及其臨床意義。
　　方法:
　　1.借助公共數據庫Oncomine Database薈萃分析不同膠質母細胞瘤患者PLOD2mRNA表達水平
　　2.借助公共數據庫REMB

8、RANDT Database分析PLOD2 mRNA在不同級別膠質瘤中的表達差異情況
　　3.免疫組織化學染色檢測不同級別膠質瘤患者PLOD2蛋白表達程度
　　4.借助TCGA數據庫Kaplan-Meier法繪制基因PLOD2不同表達程度患者的生存曲線
　　結果:
　　1.PLOD2在膠質瘤中高表達并呈現(xiàn)病理級別依賴性特征
　　借助公共數據庫Oncomine Database廣泛性地檢索患者病理組織基因芯片

9、測序結果，薈萃分析(Meta-analysis)了7個獨立膠質母細胞瘤數據庫，包含876例膠質母細胞瘤。分析結果發(fā)現(xiàn)，同正常腦組織相比，膠質母細胞瘤患者PLOD2mRNA轉錄水平一致性地高表達（Mean DifferenceⅣ Random:1.71;95％CI:1.23-2.19;P＜0.001）。此外，選用數據庫REMBRANDT Database，入選病例178例，分析PLOD2在不同級別膠質瘤中的表達程度。結果證實，膠質母細胞瘤

10、組織中的PLOD2 mRNA表達水平顯著性高于正常腦組織、Ⅰ、Ⅱ級膠質瘤(＞3倍，P＜0.0001)。免疫組織化學染色方法檢測PLOD2在9例正常腦組織、20例Ⅱ級、20例Ⅲ級、29例Ⅳ膠質瘤（膠質母細胞瘤）中的表達情況。在正常腦組織和Ⅱ級膠質瘤中，PLOD2的免疫染色呈陰性或弱陽性;但隨著腫瘤級別的升高，染色強度也隨之增強，在Ⅳ級膠質瘤中PLOD2呈強陽性，而在正常腦組織和Ⅱ級膠質瘤之間無統(tǒng)計學差異。此外，在上述結果基礎上，匯總TCG

11、A以及REMBRANDT Database中膠質母細胞瘤及非膠質母細胞瘤患者PLOD2mRNA表達數據，選用ROC曲線模型(Receiver Operating Characteristic Curve)分析PLOD2在疑診膠質母細胞瘤中的診斷價值。ROC曲線計算曲線下面積為0.785(95％CI，0.785-0.828)，提示PLOD2在膠質母細胞瘤鑒別診斷中具有較好的效度。
　　2.PLOD2表達水平與膠質母細胞瘤患者的預后呈

12、負相關
　　借助TCGA數據庫，剔除臨床信息不全病例，分別納入病例522例(OS)及386例(PFS)，采用Kaplan-Meier法繪制PLOD2低表達和PLOD2高表達患者的生存曲線。結果發(fā)現(xiàn)，低表達組患者中位總生存期(OS)為14.95個月(95％CI，9.484-20.052個月)，而高表達組的中位OS為13.93個月(95％ CI，12.884-15.020個月);低表達組的中位無進展生存期(PFS)為10.22個月(9

13、5％ CI，6.03-14.41個月)，而高表達組的中位PFS為7個月（95％CI，6.141-7.859個月）。使用Log-rank test統(tǒng)計分析:低表達組和高表達組的OS和PFS之間差別均有統(tǒng)計學意義（OS，P＜0.05; PFS，P＜0.0005）。
　　結論:
　　1.PLOD2在膠質瘤中高表達并與腫瘤級別呈正相關性;
　　2.PLOD2表達程度與膠質母細胞瘤患者的預后呈負相關。
　　第二部分乏氧調控

14、膠質瘤賴氨酸羥化酶PLOD2的表達
　　目的:
　　探究乏氧調控膠質瘤細胞賴氨酸羥化酶PLOD2的表達機制
　　方法:
　　1.Western blot檢測乏氧處理后膠質瘤細胞系U87和U251中PLOD2表達水平
　　2.Western blot檢測敲除內源性HiF-1α或HiF-2α或加入HiF-1α抑制劑后乏氧誘導膠質瘤細胞系U87和U251 PLOD2的表達情況
　　3.PLOD2轉錄水平同H

15、iF-1α轉錄水平的相關分析
　　結果:
　　乏氧通過乏氧誘導因子-1α(HiF-1α)誘導PLOD2的表達
　　在細胞U87與U251中，為了驗證乏氧能否誘導PLOD2的表達，收集乏氧處理48 h的細胞，分別從mRNA和蛋白水平檢測PLOD2表達程度，同時裂解乏氧不同持續(xù)時間(0，6h，12h，24h，48h)處理后的細胞并進行Western blot檢測。結果顯示，乏氧可以誘導U87和U251中PLOD2的表達。同

16、常氧組相比，乏氧處理后的腫瘤細胞PLOD2表達水平被顯著性提高2～3倍且呈時間依賴性。采用siRNA敲除實驗，進一步研究乏氧是通過HiF-1α還是HiF-2α來轉錄調控PLOD2的表達的。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)敲除U87與U251中內源性HiF-1α后可以抑制乏氧誘導的PLOD2的表達;但是敲除內源性HiF-2α并未抑制PLOD2的表達。為了進一步證實上述結果，將HiF-1α特異性抑制劑PX-478加入細胞培養(yǎng)基中，結果再次證

17、實乏氧通過HiF-1α誘導PLOD2的表達。此外，TCGA數據庫大數據相關分析結果同樣支持上述結果:在膠質母細胞瘤患者中，PLOD2mRNA轉錄水平同HiF-1α mRNA轉錄水平呈正相關(r2=0.215，P＜0.0001)。
　　結論:
　　乏氧通過HiF-1α調控膠質瘤細胞中PLOD2的表達
　　第三部分賴氨酸羥化酶PLOD2在乏氧誘導膠質瘤遷移與侵襲中的作用及機制
　　目的:
　　明確賴氨酸羥化酶P

18、LOD2在乏氧誘導膠質瘤遷移與侵襲中的作用及相關機制
　　方法:
　　1.CCK8細胞增殖實驗/平板克隆實驗檢測敲除PLOD2后膠質瘤細胞系U87和U251增殖能力變化
　　2.ELISA檢測乏氧處理后膠質瘤細胞系U87和U251上清中Ⅰ型膠原纖維含量變化情況
　　3.Transwell小室遷移模型檢測敲除PLOD2后乏氧誘導膠質瘤細胞系U87和U251遷移能力變化
　　4.3D侵襲模型檢測敲除PLOD2后

19、乏氧誘導膠質瘤細胞系U87和U251侵襲能力變化
　　5.高分辨激光共聚焦顯微鏡觀察敲除PLOD2后乏氧誘導膠質瘤細胞系U87和U251形態(tài)改變情況
　　6.動物體內實驗驗證敲除PLOD2后膠質瘤細胞系U251顱內侵襲能力變化
　　結果:
　　1.敲除PLOD2不影響膠質瘤細胞的增殖能力及膠原纖維合成
　　為了研究PLOD2是否調控膠質瘤細胞的惡性進展，我們首先構建了特異性敲除PLOD2慢病毒載體shPLO

20、D2及陰對照慢病毒載體shNC。為了檢驗敲除PLOD2后膠質瘤細胞增殖能力及膠原合成能力的變化情況，我們選用上述慢病毒載體構建了穩(wěn)定敲除PLOD2的膠質瘤細胞系U87和U251。CCK8細胞生長曲線顯示，敲除PLOD2未改變腫瘤細胞的增殖能力，同時，細胞克隆形成能力也未受影響。對于PLOD2敲除后腫瘤細胞培養(yǎng)上清中Ⅰ型膠原蛋白含量的變化情況，我們選用人源Collagen I ELISA試劑盒檢測。結果證實，乏氧本身可以誘導膠質瘤細胞Ⅰ型

21、膠原纖維的合成與分泌，但敲除PLOD2后未影響該過程。
　　2.敲除PLOD2抑制膠質瘤細胞的遷移與侵襲
　　分別將穩(wěn)定敲除PLOD2(shPLOD2)和陰性對照(shNC)膠質瘤細胞U87和U251接種到遷移模型Transwell小室的上室，下室添加含20％FBS的完全培養(yǎng)基，然后將模型置于常氧或乏氧下12h。結果顯示，雖然乏氧促進U87和U251的遷移（～1.5倍，P＜0.001），但是敲除PLOD2后，腫瘤細胞遷移能力

22、顯著下降（＞30％，P＜0.001）。3D侵襲模型實驗結果發(fā)現(xiàn)，在乏氧條件下，U87與U251細胞均增殖為結構良好的瘤球體，并且向周圍基質最大程度的放射狀侵襲，敲除PLOD2后，腫瘤細胞侵襲基質膠能力明顯下降，尤其是在乏氧條件下。
　　3.PLOD2通過FAK信號通路促進膠質瘤細胞的遷移與侵襲
　　一方面，腫瘤細胞通過分泌基質金屬蛋白酶MMPs協(xié)助自身侵襲，而我們Western blot的檢測結果證實，在常氧和乏氧環(huán)境下腫瘤

23、細胞U87和U251MMP-2和MMP-9的表達水平在敲除PLOD2前后未受影響。另一方面，腫瘤細胞遷移與侵襲過程中往往伴隨細胞形態(tài)、骨架及黏著斑的變化。高分辨激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)乏氧可以顯著性促進腫瘤細胞表面黏著斑的形成，表現(xiàn)為樁蛋白(Paxillin;綠色)與肌動蛋白纖維(Phalloidin;紅色)在黏著斑上共定位的增加。在常氧和乏氧狀態(tài)下，敲除PLOD2后黏著斑形成數目降低，肌動蛋白纖維排列雜亂。目前認為調控細胞形態(tài)及黏著斑

24、形成的關鍵蛋白是黏著斑激酶(Focal adhesionkinase，F(xiàn)AK)。結合形態(tài)學結果，我們推測FAK可能是PLOD2的下游靶分子。Western blot檢測檢測發(fā)現(xiàn)在常氧或乏氧環(huán)境下，敲除PLOD2可顯著性降低腫瘤細胞U87和U251中FAK磷酸化水平(FAK-p397)。為進一步明確結果，我們使用FAK特異性抑制劑TAE226處理膠質瘤細胞，數據顯示在乏氧誘導腫瘤細胞高表達PLOD2的同時，F(xiàn)AK抑制劑TAE226可以抑制

25、FAK磷酸化水平(FAK-p397)。而且，在常氧及乏氧環(huán)境下，加入TAE226后腫瘤細胞的遷移與3D侵襲均受到抑制。
　　4.動物實驗:PLOD2可以促進膠質瘤細胞侵襲
　　分別選用皮下成瘤及顱內原位種植腫瘤裸鼠模型加以驗證，在皮下成瘤模型實驗中，U251-shPLOD2組與U251-shNC組相比，腫瘤體積無明顯差別。ELISA試劑盒檢測瘤體內羥脯氨酸含量，間接反映瘤體內Ⅰ型膠原纖維含量，結果證實兩組間無明顯差別。瘤體硬

26、度測定實驗發(fā)現(xiàn)，與U251-shN組相比，U251-shPLOD2組瘤體硬度明顯降低(P＜0.05）。在顱內原位種植膠質瘤模型中，U251-shNC組瘤體不規(guī)則，腫瘤細胞局部浸潤明顯，而U251-shPLOD2組瘤體呈現(xiàn)局限性，邊界清晰。天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)，U251-shNC組瘤體內膠原纖維排布交錯密集，分布于腫瘤細胞周圍，而在U251-shPLOD2組中膠原纖維分布散在，較少形成交聯(lián)。
　　結論:
　　1.PLOD2通過FA