脯氨酸羥化酶3對(duì)胃癌的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:胃癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，全世界約有40％的胃癌病例發(fā)生在我國(guó)。近年來發(fā)病率雖略有下降，但總體療效并未獲得明顯改善，而對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的探討，無疑將為其臨床治療提供新的理論依據(jù)。已經(jīng)證明，胃癌的發(fā)生是一個(gè)多因素，多步驟的長(zhǎng)期過程，涉及到一系列原癌基因的激活，和抑癌基因突變導(dǎo)致的失活，闡明這些基因在胃癌形成中的作用具有重要意義。
　　脯氨酸羥化酶(Prolyl hydroxylase domain protein，PH

2、Ds)被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子，對(duì)PHDs在腫瘤中作用的研究也取得了一定進(jìn)展，其中的脯氨酸羥化酶3(PHD3)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系更倍受關(guān)注，已成為研究熱點(diǎn)。最近，我們通過檢索美國(guó)NCI數(shù)據(jù)庫并委托查新檢索，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)PHD3與胃癌關(guān)系的深入研究報(bào)道。PHD3在胃癌進(jìn)程中的作用及相關(guān)作用機(jī)制都還不明確，值得進(jìn)一步探索。
　　目的:檢測(cè)PHD3在人胃癌細(xì)胞系(AGS、MKN-28、BGC-823、HCG-27、SGC-79

3、01和MKN-45)、人正常胃上皮細(xì)胞GES及人胃癌組織的表達(dá)，探討PHD3對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。
　　方法:
　　1、胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中PHD3表達(dá)
　　Real-time PCR法檢測(cè)新鮮胃癌組織及配對(duì)的癌旁非腫瘤胃粘膜中PHD3的表達(dá)。Real-time PCR法檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存的胃癌細(xì)胞株(AGS、MKN-28、BGC-823、HCG-27、SGC-7901和MKN-45)及人正常胃上皮細(xì)胞G

4、ES中PHD3的表達(dá)情況。
　　免疫組化法檢測(cè)100例胃癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁“正?！苯M織的PHD3表達(dá)，收集胃癌的臨床病理資料，分析PHD3表達(dá)與胃癌臨床病理因素（如腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、病理學(xué)類型、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期以及生存期等）的關(guān)系。
　　2、PHD3對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)作用研究
　　構(gòu)建pYr-1.1-EGLN3-shRNA真核表達(dá)載體（PHD3又稱EGLN3），并轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞。通過RT-Q

5、PCR、Western-Blot檢測(cè)，成功獲得PHD3表達(dá)最低的實(shí)驗(yàn)（BGC-823-shEGLN3、AGS-shEGLN3）和表達(dá)最高的陰性對(duì)照組(BGC-823-EGFP-shNC、AGS-EGFP-shNC)細(xì)胞。
　　觀察轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力等一系列體外實(shí)驗(yàn)的變化。
　?、僭鲋吃囼?yàn):檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后的腫瘤細(xì)胞在0，24h，48h，72h各個(gè)時(shí)段的細(xì)胞增殖情況，并繪制成增殖曲線。
　　②遷移侵襲實(shí)驗(yàn):

6、用Transwell小室作為腫瘤細(xì)胞體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的模型，在上室表面鋪或不鋪Matrigel，并于上室中加入2×106 Cell/ml個(gè)轉(zhuǎn)染前后的腫瘤細(xì)胞，下室加入含3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清液，觀察下調(diào)PHD3表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:與癌旁非腫瘤胃粘膜相比，胃癌組織內(nèi)PHD3表達(dá)下調(diào)，57％的(57/100)胃癌患者呈PHD3低表達(dá)。PHD3的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤大小、Lauren分型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

7、移分期負(fù)相關(guān)。PHD3低表達(dá)患者生存時(shí)間較高表達(dá)患者短，5年生存率低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　PHD3在人胃癌細(xì)胞株AGS、MKN-28、BGC-823、HCG-27、SGC-7901和MKN-45的表達(dá)量顯著低于人正常胃上皮細(xì)胞GES的表達(dá)量。
　　人胃癌細(xì)胞株BGC-823和AGS轉(zhuǎn)染PHD3抑制表達(dá)載體（pYr-1.1-EGLN3-shRNA）24小時(shí)后，經(jīng)RT-PCR、western-blot驗(yàn)證目的基因EGLN3

8、表達(dá)產(chǎn)物PHD3含量降低。轉(zhuǎn)染PHD3抑制載體48小時(shí)、72小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組（pYr-1.1-EGLN3-shRNA）的BGC-823和AGS的增殖率顯著高于陰性對(duì)照組（pYr-1.1-EGFP-nc）。實(shí)驗(yàn)組BGC-823細(xì)胞遷移數(shù)顯著多于陰性對(duì)照組，差異具有顯著性;而在AGS細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比，透過膜的細(xì)胞數(shù)量無明顯增加。人胃癌細(xì)胞株BGC-823和AGS轉(zhuǎn)染后，做侵襲實(shí)驗(yàn)，48小時(shí)后HE染色觀察結(jié)果，BGC-823細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

9、組穿過QCM ECMatrix Cell Invasion Assay膜的數(shù)量較陰性對(duì)照組顯著增加，AGS細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組較陰性對(duì)照組，細(xì)胞透膜數(shù)量無明顯增多。
　　結(jié)論:
　　1.與癌旁非腫瘤胃粘膜相比，胃癌組織內(nèi)PHD3在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均表現(xiàn)為表達(dá)下降。
　　2.人胃癌組織內(nèi)PHD3表達(dá)強(qiáng)度，與Lauren分型、腫瘤大小，浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量相關(guān)。低表達(dá)患者，腫瘤侵襲能力高，生存時(shí)間短。
　　3.PHD3在人胃