中國(guó)紅豆杉中新的羥化酶基因克隆與功能分析.pdf

1、紫杉醇是一種具有強(qiáng)大抗癌功效的萜類(lèi)化合物，在紅豆杉中含量極低。目前主要利用半合成、天然產(chǎn)物提取獲得，市場(chǎng)供需矛盾激烈?；诤铣缮飳W(xué)理念的異源生物合成是實(shí)現(xiàn)紫杉醇高量生產(chǎn)的途徑之一，但其前提是徹底解析目標(biāo)產(chǎn)物的代謝途徑。羥化酶的克隆與羥化次序的確定是紫杉醇生物合成途徑研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究擬克隆中國(guó)紅豆杉中新的羥化酶，并對(duì)其功能進(jìn)行分析，取得以下結(jié)果：
　　(1)中國(guó)紅豆杉中新的羥化酶的克隆與分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)定的紅豆杉轉(zhuǎn)錄組

2、數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)了266個(gè)細(xì)胞色素P450酶基因序列片段，其中歸屬于CYP716和CYP725亞家族的基因片段39個(gè)。對(duì)其中4個(gè)包含完整的ORF的候選基因（cyp1，cyp2，cyp3，cyp4）進(jìn)行了克隆，并對(duì)其同源性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)CYP1與來(lái)源于美國(guó)西加云杉的CYPA1同源性為71％，CYP2，CYP3，與 T10H的同源性分別為70%，74%，CYP4與煙草中的CYP716B1同源性為45%。
　　(2)4個(gè)候選羥化酶

3、基因（cyp1，cyp2，cyp3，cyp4）的原核表達(dá)。將4個(gè)候選羥化酶基因利用合適的酶切位點(diǎn)分別構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET-32a。考察了IP TG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等對(duì)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，最佳誘導(dǎo)條件為：IP TG濃度0.08 mM，誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)5 h，溫度20℃，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白以包涵體形式存在。
　　(3）分別采用CO差光法和羥化酶體外反應(yīng)體系對(duì)表達(dá)的羥化酶蛋白活性和功能進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)CYP2蛋白在CO吹泡后在450