黃鱔FTZ-F1克隆、表達(dá)和功能分析及cyp19a1a上游調(diào)控因子的篩選.pdf

1、ftz—f1是核受體超家族的一員，編碼孤核受體FTZ—F1。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多它的同源基因。研究證明它在類(lèi)固醇生成、性別分化過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用。 本實(shí)驗(yàn)室前期已從黃鱔性腺cDNA文庫(kù)中獲得了兩個(gè)ftz—f1的同源基因，eff1a中間片段和5'片段以及eff1b全長(zhǎng)序列。在此基礎(chǔ)上，本文克隆了eff1a3'片段，發(fā)現(xiàn)了eff1a的一種剪接形式eff1a—s，并對(duì)這三種形式的FTZ—F1的表達(dá)和功能進(jìn)行了分析。 ef

2、f1a cDNA全長(zhǎng)為1892bp，具有211bp的5'UTR和223bp的3'UTR，編碼框?yàn)?458bp，編碼486個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)；而eff1b cDNA全長(zhǎng)為1689bp，具有89bp的5'UTR和202bp的3'UTR，其編碼框?yàn)?398bp，編碼466個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。eff1a的一種選擇性剪切形式eff1a—s cDNA全長(zhǎng)為1505bp，具有211bp的5'UTR和292bp的3'UTR，編碼框?yàn)?002bp，編碼334

3、個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，是eff1a的C末端缺失的形式，缺少配體結(jié)合區(qū)及AF2功能域。這種缺失形式在斑馬魚(yú)的zff1a中也發(fā)現(xiàn)過(guò)。 序列分析表明這個(gè)兩個(gè)基因具有孤核受體家族的典型結(jié)構(gòu)，并且具有FTZ—F1家族特有的FTZ—F1box。進(jìn)化樹(shù)分析表明eFF1a屬于FTZ—F1家族的NR5A4亞家族，與尼羅羅非魚(yú)的SF-1相似性最高；eFF1b與斜帶石斑魚(yú)的ftz—f1和斑馬魚(yú)的zFF1d最接近，同屬于NR5A4亞家族。 采用RT

4、—PCR的方法檢測(cè)eff1a，eff1a—s和eff1b在雌性和雄性黃鱔各組織的表達(dá)情況，結(jié)果顯示： 1) eff1a在雌性中表達(dá)廣泛，在卵巢和胰臟中高表達(dá)，其次是下丘腦和脾臟，在視項(xiàng)蓋—丘腦、延髓、垂體、心臟、肝臟、血液、和眼睛有微弱表達(dá)；在雄性的垂體、精巢和脾臟高表達(dá)，在下丘腦和胰臟檢測(cè)到有表達(dá)，其他組織未檢測(cè)到表達(dá)； 2) eff1a—s在雌性的卵巢和脾臟中表達(dá)，垂體和胰臟微量表達(dá)；在雄性的精巢和胰臟檢測(cè)到表達(dá)，下

5、丘腦中微量表達(dá)； 3) eff1b在雌性中只在垂體和卵巢中檢測(cè)到表達(dá)；在雄性的垂體和精巢高度表達(dá)，其次是下丘腦、胰臟和心臟，在視頂蓋—丘腦有微量表達(dá)，未在其他組織檢測(cè)到。 本文構(gòu)建了eff1a、eff1a—S和eff1b的pcDNA3.0真核表達(dá)載體，研究eFF1a、eFF1a—S和eFF1b對(duì)黃鱔cyp19ala啟動(dòng)子的作用，結(jié)果表明：在小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4中，eFF1a和eFF1b都能刺激黃鱔卵巢芳香化酶(cyp1

6、9ala)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄；eFF1a—S可以抑制eFF1a和eFF1b對(duì)黃鱔cyp19ala啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用。 在性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，cyp19ala的表達(dá)一直下降。為了找到調(diào)控cyp19ala表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，本文對(duì)應(yīng)用寡核苷酸偶聯(lián)磁珠沉淀法篩選cyp19ala上游調(diào)控因子進(jìn)行了初步探索。針對(duì)黃鱔cyp19ala近端啟動(dòng)子，設(shè)計(jì)一對(duì)引物(其中反向引物用生物素標(biāo)記)，擴(kuò)增位于TATA—box上游約360bp的保守序列，利用生物素與