杜仲膠合成相關(guān)基因EuREF1克隆及表達(dá)分析.pdf

1、本研究以杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)7月雌株嫩葉與新生幼枝為材料，根據(jù)杜仲轉(zhuǎn)錄組庫(kù)的片段注釋信息，采用5’-末端轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)換cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Switching Mechanism At5’-end of the RNA Transcript Rapid Amplification of cDNA Ends,SMART RACE)從杜仲中成功克隆了編碼杜仲橡膠延長(zhǎng)因子(rubber elongation f

2、actor,REF)的全長(zhǎng)cDNA序列，該序列命名為EuREF1。分別構(gòu)建了EuREF1基因的原核表達(dá)系統(tǒng)（pGEX-GST-EuREF1）和植物表達(dá)系統(tǒng)（pSH-35S-EuREF1），研究了EuREF1基因的表達(dá)情況。本研究獲得的結(jié)果如下：
　　1、EuREF1的cDNA序列全長(zhǎng)1075bp，開(kāi)放閱讀框678bp，編碼225個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示：EuREF1蛋白分子量約為24.9768 kDa，理論等電點(diǎn)pI為6.32

3、；氨基酸組成中以丙氨酸（11.1％）、纈氨酸（11.1%）、亮氨酸（8.4%）含量為最高，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為30.63，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。預(yù)測(cè)EuREF1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占66.67%，β-折疊占4.89%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占28.44%，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)。NCBI進(jìn)行EuREF1核酸序列blastn比對(duì)，結(jié)果顯示同源性最高的是鷹嘴豆（76%，Cicer arietinum XM_004502239.1）和梅花（69%，Prunus

4、 mume XM_008223935.1）的REF核酸序列；NCBI進(jìn)行EuREF1氨基酸序列blastp比對(duì)，結(jié)果顯示同源性最高的是葡萄（42%，Vitis vinifera XP_002278036.1）和蓖麻（41%，Ricinus communis XP_002514917.1）的REF蛋白序列。保守結(jié)構(gòu)域分析認(rèn)為EuREF1具有與橡膠延長(zhǎng)因子一致的區(qū)域。分析NCBI中已報(bào)道的所有REF蛋白序列，選取已報(bào)道的每個(gè)種屬中具有代表性

5、的、氨基酸序列完整的一個(gè)序列作為數(shù)據(jù)源，以此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示杜仲EuREF1在進(jìn)化歷程上與絕大多數(shù)植物的REF親緣性較遠(yuǎn)，與之最近的為三葉橡膠REF。
　　2、在初始載體pGEX-6p-1的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了EuREF1基因的原核表達(dá)系統(tǒng)（pGEX-GST-EuREF1）并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)。使用1mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，產(chǎn)生了約為45kDa的蛋白，與預(yù)測(cè)的GST

6、::EuREF1融合蛋白相對(duì)分子量大小相近。說(shuō)明EuREF1蛋白能在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，含有pGEX-GST-EuREF1的大腸桿菌表達(dá)菌株BL21可用于生產(chǎn)EuREF1蛋白。
　　3、在初始載體pSH737的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了EuREF1基因的雙子葉植物表達(dá)系統(tǒng)（pSH-35S-EuREF1），并使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化普通煙草(Nicotiana. tabacum L.)品種長(zhǎng)脖黃，對(duì)獲得的抗性植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色和基因組P