玫瑰花青素苷合成相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、玫瑰是薔薇科薔薇屬重要的觀花植物，現(xiàn)已應(yīng)用于園林景觀綠化、食品工業(yè)、藥用產(chǎn)業(yè)等各個(gè)方面，具有很大的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。花色是玫瑰的重要觀賞性狀之一，玫瑰品種較多，但花色單一，嚴(yán)重的自交和種間雜交障礙限制了玫瑰花色的創(chuàng)新及在國內(nèi)外市場的發(fā)展。分子育種是培育新品種的新方法，目前對玫瑰花色發(fā)育的分子基礎(chǔ)還缺乏深入研究，這在一定程度上制約了玫瑰花色的改良?；ㄇ嗨厥侵参锘ㄆ鞴俚淖钪饕某噬镔|(zhì)，在模式植物中其生物合成途徑已經(jīng)研究的較為詳細(xì)，該途徑

2、大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因和一部分調(diào)控基因均己分離。但有關(guān)玫瑰花色形成的機(jī)理研究尚未見報(bào)道。因此對玫瑰花青素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的克隆與表達(dá)分析對于闡明玫瑰花色形成機(jī)理、利用基因工程培育新品種具有重要意義。
　　本研究以‘紫枝’玫瑰花瓣為材料，利用RT-PCR的方法分離了4個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因（CHS、CHI、F3H、DFR）的全長cDNA序列和1個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因（ANS）的部分cDNA序列。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）的方法，分析5個(gè)關(guān)鍵

3、基因在玫瑰不同花色品種、不同開花時(shí)期的差異性表達(dá)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.以‘紫枝’玫瑰盛花期花瓣的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了CHS、CHI、F3H、DFR和ANS五個(gè)結(jié)構(gòu)基因的cDNA序列，命名為RrCHS、RrCHI、RrF3H、RrDFR和RrANS。其中RrCHS、RrCHI、RrF3H和RrDFR為全長cDNA序列，分別為1167bp、711bp、1092bp和1047bp，編碼389、237、364和34

4、9個(gè)氨基酸，RrANS為部分cDNA序列，長度為562bp。利用NCBI的Blastp工具進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，5個(gè)結(jié)構(gòu)基因與其它已知植物的相關(guān)基因均具有較高的同源性。5個(gè)結(jié)構(gòu)基因獲得的GenBank登錄號分別為ALR74720.1、ALR74721.1、ALR74723.1、ALR74719.1、ALR74722.1。
　　2.運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件對4個(gè)結(jié)構(gòu)基因的蛋白分子量、理論等電點(diǎn)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)、

5、二級結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行了分析，同時(shí)在多序列比對的基礎(chǔ)上構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，4個(gè)基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹基本符合植物分類學(xué)分類，且具有較明顯的種屬特性。
　　3.對玫瑰3個(gè)品種5個(gè)時(shí)期的花青素含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示：‘紫枝’玫瑰花青素苷含量遠(yuǎn)高于‘粉紫枝’玫瑰，‘白紫枝’玫瑰含量最低，3個(gè)玫瑰品種的花青素苷含量在整個(gè)開花過程中均呈逐漸下降趨勢，與花色變化結(jié)果一致。
　　4.利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)（qRT-PCR）對本

6、研究克隆的5個(gè)結(jié)構(gòu)基因（RrCHS、RrCHI、RrF3H、RrDFR和RrANS）在3個(gè)玫瑰品種（‘紫枝’玫瑰、‘白紫枝’玫瑰和‘粉紫枝’玫瑰）5個(gè)開花時(shí)期表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明，5個(gè)結(jié)構(gòu)基因在3個(gè)玫瑰品種不同開花時(shí)期均有表達(dá)，但表達(dá)模式存在明顯的差異。RrCHS和RrDFR在3個(gè)玫瑰品種的開花過程中整體上均呈下降的表達(dá)趨勢，盛花末期的表達(dá)量最低。RrCHI在3個(gè)玫瑰品種中表達(dá)量都是隨著花的開放逐漸增加，而后隨著花的萎蔫又下降。R

7、rF3H和RrA NS在3個(gè)玫瑰品種花朵開放過程中的相對表達(dá)量變化沒有一定規(guī)律可循。此外，RrCH S、RrCHI、RrDFR與玫瑰開花過程中花青苷形成和變化密切相關(guān)，RrF3H、RrANS與花青苷含量變化沒有明顯的對應(yīng)關(guān)系。
　　5.利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)（qRT-PCR）對5個(gè)結(jié)構(gòu)基因（RrCHS、RrCHI、RrF3H、RrDFR和RrANS）在‘紫枝’玫瑰5個(gè)組織部位（莖、葉、雄蕊、雌蕊、花瓣）中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明