AtPAP1基因在煙草中的過表達(dá)及花青素合成調(diào)控.pdf

1、為實(shí)現(xiàn)花青素在煙株中的積累，探索花青素對煙葉品質(zhì)改良中的應(yīng)用研究潛力，本文克隆了擬南芥MYB家族轉(zhuǎn)錄因子PAP1，構(gòu)建組成型植物過表達(dá)載體，采用Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，實(shí)現(xiàn)PAP1基因在煙草及煙草腺毛中的異源過表達(dá)，獲得積累花青素的“紅色煙草”。同時，克隆了煙草腺毛特異表達(dá)基因CYP71D16的啟動子序列，建立了腺毛特異表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)了PAP1基因在腺毛中的特異表達(dá)，獲得了“紅色腺毛煙草”，為煙草腺毛生物反應(yīng)器開發(fā)研究奠定了基礎(chǔ)。主要研

2、究結(jié)果如下:
　　1.PAP1基因在煙草中組成型表達(dá):克隆PAP1基因插入pCAMBIA1391載體，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pC1391-35S-PAP1;在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草T.I1068，在附加2mg/L的PPT篩選壓的MS+6BA1.5+IAA0.1分化培養(yǎng)基上獲得紅色幼芽，并在生根培養(yǎng)基MS+NAA0.1上再生植株。分子檢測證明PAP1基因在煙草中實(shí)現(xiàn)了整合和轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)基因植株葉片中花青素積累，并受到強(qiáng)光誘導(dǎo)。

3、>　　2.煙草腺毛特異表達(dá)體系的建立:克隆了煙草腺毛特異表達(dá)基因CYP71D16的啟動子序列，并將其插入植物表達(dá)載體pCAMBIA1391中，構(gòu)建了煙草腺毛特異表達(dá)載體pCAMBIA1391-CYP-GUS。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草，在附加9mg/L潮霉素(Hyg)的MS+6BA1.5+ IAA0.1分化培養(yǎng)基上篩選到了抗性植株。分子檢測證明，GUS基因在煙草基因組中進(jìn)行了整合和轉(zhuǎn)錄。組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株葉片表面腺毛

4、呈現(xiàn)特異的藍(lán)色反應(yīng)，表明GUS基因在煙草葉面腺毛中成功實(shí)現(xiàn)了特異表達(dá)。
　　3.PAP1基因在煙草腺毛中的特異表達(dá):構(gòu)建pCAMBIA1391-CYP-PAP1表達(dá)載體，采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草T.I1068。在附加9mg/L潮霉素(Hyg)的MS+6BA1.5+IAA0.1分化培養(yǎng)基上篩選到了抗性植株。分子檢測證明，PAP1基因在煙草基因組中進(jìn)行了整合和轉(zhuǎn)錄;顯微觀察發(fā)現(xiàn)煙草葉片腺毛呈現(xiàn)淺紅色，初步證明花青素在轉(zhuǎn)基因煙草腺毛中的特異積

5、累。
　　4.轉(zhuǎn)基因植株的比較分析:對PAP1組成型表達(dá)的“紅色煙草”和腺毛特異表達(dá)的“紅色腺毛煙草”進(jìn)行了化學(xué)和形態(tài)學(xué)分析。LC/MS檢測表明，“紅色煙草”葉片中含有較高的矢車菊色素(Cya)和少量的天竺葵色素(Pel)，“紅色腺毛煙草”葉片中僅含有少量的矢車菊色素(Cya)，而對照T.I1068葉片中不含花青素。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，“紅色煙草”與未轉(zhuǎn)化煙草對照相比，表型發(fā)生較大變化，葉片呈淺紅色，莖稈彎曲，葉緣卷曲;而“紅色腺毛煙草