茶樹MYB轉錄因子CsAN1調控花青素的作用機制研究.pdf

1、花青素是植物界中最大的水溶性色素家族，也是類黃酮類家族中的一員。在植物體內，花青素充當著響應生理和環(huán)境變化的保護機制，有利于植物應對各種生物和非生物脅迫?；ㄇ嗨剡€是一種天然的抗氧化劑，能夠保護人體免受自由基等有害物質的傷害，并且在增強血管彈性、預防心腦血管疾病、保護肝臟等方面有著重要的作用。此外，花青素作為一種天然無害色素，在食用色素開發(fā)中有著廣泛的應用前景。在模式植物、花卉以及果樹中花青素的合成及轉錄調控機制已研究得較為清楚，但是關于

2、茶樹花青素代謝途徑轉錄水平的調控機制及轉錄因子的作用機理尚不明確。
　　本文以高花青素含量茶樹品種“紫娟”（Camellia sinensisvar．assamica，cv.Zijuan）為材料，通過轉錄組測序和qRT-PCR找到了四個與類黃酮類合成相關的MYB轉錄因子。其中CsAN1的表達量與“紫娟”中花青素的含量呈極顯著的相關性，因此我們對其做了進一步的功能驗證，結果如下：
　　1.以“紫娟”葉片cDNA為模板，克隆了C

3、sAN1、CsGL3、CsEGL3以及CsTTG1的全長，并對這幾個基因的氨基酸序列進行分析和聚類。其中CsAN1具有R2R3-MYB轉錄因子的典型結構特征，并具有bHLH的結合位點和調控花青素合成的KPRPR[S/T]F結構域。聚類分析表明CsAN1與中華獼猴桃中調控花青素合成基因AcMYB110的相似性最高，達到58％。
　　2. CsAN1轉化本氏煙草促進花青素的積累為了檢測CsAN1在植物體的功能，構建了35S::CsAN

4、1超表達載體轉化本氏煙草。CsAN1異位表達促進了煙草葉片花青素的積累，并導致花青素合成結構基因上調表達，這說明CsAN1參與植物花青素的合成。
　　3. CsAN1具有轉錄激活功能并能結合到CsLDOX1和CsLDOX2的啟動子上反式激活和酵母單雜交實驗結果表明：CsAN1具有自主激活功能，并且能結合到花青素合成關鍵基因CsLDOX1和CsLDOX2的啟動子上。這說明CsAN1能參與調控茶樹花青素的合成。
　　4. CsA

5、N1是MBW復合物的成員酵母雙雜交與雙分子熒光互補實驗結果表明：CsAN1與 CsGL3、CsEGL3互作，但不與CsTTG1互作，而CsTTG1也能與CsGL3、CsEGL3互作，這暗示暗示了茶樹中也 CsAN1、CsGL3、CsEGL3和 CsTTG1可能形成 MBW存在有 MYB、bHLH和WD40重復蛋白形成的MBW三元復合物形式轉錄調控功能。
　　5. MBW復合物轉錄調控CsLDOX2啟動子的活性雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗

6、結果顯示：CsAN1能提高CsLDOX2啟動子的活性。同時共轉CsAN1、CsTTG1和CsGL3三個基因，CsLDOX2啟動子活性提高更為顯著。這也從側面輔助證明了CsAN1是通過形成MBW復合物調控花青素合成基因的表達。
　　6.“紫娟”CsAN1啟動子的低甲基化水平與高花青素含量相關利用hiTAIL PCR技術從四個不同茶樹品種中克隆出CsAN1的啟動子序列，之后用亞硫酸氫鹽測序分析了“紫娟”和其他綠葉茶樹品種CsAN1啟動