茶樹花青素還原酶的酶學特性研究.pdf

1、兒茶素是茶樹的主要次生代謝產物,也是決定茶葉品質及其健康功效的重要組分。茶樹花青素還原酶(CsANR)可以催化花青素轉變?yōu)橄鄳?,3-順式-黃烷-3-醇,它是決定茶樹兒茶素合成的直接酶類。作為原花青素生物合成途徑中的關鍵酶,國內外研究者及本課題組前期工作已經對花青素還原酶基因及其酶學性質有了初步研究,但是也發(fā)現(xiàn)了很多疑問。
　　本文首先初步純化了茶樹鮮葉中和通過原核表達的CsANR蛋白,并采用C18柱和旋光異構柱分離,結合HPL

2、C技術,鑒定了兩種來源的ANR蛋白酶反應產物的差異。其次,利用原核表達的重組ANR蛋白,比較了兩種重組ANR酶的酶學特性差異。
　　主要研究結果如下:
　　1.為排除茶樹鮮葉中的氧化酶干擾,本文采取硫酸銨沉淀法,對CsANR酶進行了初步純化。結果發(fā)現(xiàn),CsANR酶反應產物更易于檢測。利用C18柱和旋光異構柱分離,結合HPLC檢測技術,對來自茶鮮葉的CsANR酶反應產物進行分析,結果表明,以矢車菊色素(CYA)和飛燕草色素(D

3、EL)為底物時,CsANR酶生成的主要產物分別是2,3-順式-黃烷-3-醇(-)EC和(-)EGC,沒有發(fā)現(xiàn)2,3-反式-黃烷-3-醇產物C和GC的生成。
　　2.進行了CsANR1和CsANR2的原核表達。利用鈷離子親和樹脂,對CsANR1和CsANR2融合蛋白進行了分離純化,得到目的蛋白。利用C18柱和旋光異構柱分離,結合HPLC檢測技術,對CsANR1和CsANR2融合蛋白進行酶活檢測及產物鑒定。結果顯示,以CYA為底物時,

4、重組CsANR1或CsANR2酶生成的主要產物是(-)C和(+)EC;以DEL為底物時,重組CsANR1或CsANR2酶生成的主要產物是EGC和GC。在NADP+存在的條件下,沒有檢測到重組CsANR具有催化(+)C和(-)EC之間相互的差向異構作用。
　　以上結果提示,來自茶樹鮮葉的蛋白與原核表達的重組蛋白之間的酶反應產物并不一致。
　　3、對重組CsANR1和CsANR2的酶學特性進行研究分析。結果表明,CsANR1酶的

5、最適反應溫度為40℃,最適pH值為6.5;CsANR2酶的最適反應溫度為40℃,最適pH值為5.5。從底物特異性結果看,CsANR1酶以CYA為底物時的親和力高于DEL,但DEL的Kcat/Km值卻要高于CYA;而CsANR2酶以DEL為底物時的親和力高于CYA,且DEL的Kcat/Km值也高于CYA。此外,大多數(shù)金屬離子對兩種酶有抑制作用,特別是Hg2+,在1mM的濃度下兩種酶已完全失活。但Al3+在1mM濃度下卻對CsANR1酶有促