蓮房原花青素對老年癡呆的防治作用及其機制的研究.pdf

1、本文是在在本課題組發(fā)現(xiàn)蓮中富含低聚原花青素,并證實其能有效清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、調(diào)節(jié)血脂、保護心臟研究基礎(chǔ)上,旨在利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、分子生物技術(shù)和藥理實驗方法,從抗氧化、病理形態(tài)、細(xì)胞凋亡、基因調(diào)控、改善神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的代謝等角度,針對我國和世界人口老齡化及老年癡呆患者日益增多的趨勢,根據(jù)此病發(fā)病的β淀粉樣蛋白(Aβ)級聯(lián)學(xué)說與自由基學(xué)說,以蓮中活性因子-原花青素為對象,選用乙醇和東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶障礙、D-半乳糖致亞急性衰老和快速衰老小

2、鼠SAMP8等四種不同類型的老年性癡呆動物模型以及Aβ1-42誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷模型,系統(tǒng)研究和探討了蓮原花青素對老年性癡呆的預(yù)防和治療作用及其分子機制,以填補蓮原花青素抗老年性癡呆這一研究空白,為預(yù)防和治療老年性癡呆探索新思路,新方法,為尋找新的老年性癡呆天然有效藥物及保健品提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ),并有利于促進我國蓮資源的綜合開發(fā)和利用。同時也為原花青素-這類自然界中廣泛存在的一大類酚類化合物的改善認(rèn)知功能的作用研究提供科學(xué)參考。<

3、br>　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.蓮房原花青素對學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠的改善作用的研究
　　 1.1 LSPC對乙醇致小鼠學(xué)習(xí)記憶再現(xiàn)障礙的改善作用
　　 小鼠連續(xù)灌胃22.5 mg/kg bw、45 mg/kg bw和90mg/kg bw LSPC20天,制備40％乙醇所致學(xué)習(xí)記憶障礙模型小鼠,采用Y迷宮法觀察,結(jié)果顯示三種不同劑量的LSPC對乙醇致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠均有顯著地改善作用,其中90mg/kgbw

4、 LSPC組的錯誤次數(shù)低于正常對照組,效果優(yōu)于陽性對照藥物腦復(fù)康。而且三種不同劑量均可減少小鼠腦中MDA的含量、提高SOD活性和降低MAO—B活性,并達到極顯著水平。說明LSPC對乙醇誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有很好的改善作用,其機制可能與抑制乙醇引起的小鼠腦中MAO-B活性的升高,同時減少神經(jīng)元的氧化損傷有關(guān)。
　　 1.2 LSPC對東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶獲得障礙的改善作用
　　 小鼠連續(xù)灌胃30 mg/kg bw、60

5、 mg/kg bw、90 mg/kg bw和150 mg/kg bwLSPC20天,制備3mg/kg東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙模型小鼠,采用Y迷宮法觀察,顯示四種不同劑量的LSPC對東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠均有顯著地改善作用。攝入適量的LSPC可減少小鼠腦中MDA和NO的含量、提高SOD活性和降低總NOS、神經(jīng)型NOS和AchE活性,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,均達到顯著性水平。說明LSPC對東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙也有很好的改善作用,其機制可

6、能與抑制東莨菪堿引起的小鼠腦中AchE活性的升高,同時減少神經(jīng)元的氧化損傷有關(guān)。此外,LSPC能顯著減少衰老小鼠腦中作為炎癥因子和與睡眠覺醒有關(guān)的NO的含量,提示LSPC還可能通過改善睡眠改善學(xué)習(xí)記憶功能,這是一個不可忽視的潛在的重要因素,關(guān)于這一點尚有待進一步研究。
　　 2.蓮房原花青素對D-半乳糖致亞急性衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用及機制的研究
　　 以頸部皮下注射120mg/kg bw D-半乳糖的方式造模,在造模

7、型的同時,給予實驗小鼠30、60、90 mg/kg bw LSPC8周,采用Y迷宮和跳臺法顯示三種不同劑量的LSPC對小鼠學(xué)習(xí)記憶過程均有顯著地改善作用。并能顯著降低衰老小鼠血清中β-AP含量,降低衰老小鼠腦組織中MDA和NO含量,降低腦組織中AchE、MAO-B、總NOS、iNOS和nNOS活性,同時提高SOD、GSH-Px的活性。LSPC能抑制神經(jīng)細(xì)胞異常,發(fā)生凋亡,減少促凋亡基因P53蛋白的表達。這些結(jié)果提示LSPC對D-半乳糖致

8、衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善機理有三。其一,提高體內(nèi)抗氧化酶活性,抑制組織中自由基及其中間有毒產(chǎn)物的產(chǎn)生,抑制細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。其二,抑制神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡,保護細(xì)胞免受損傷。其三,增強與認(rèn)知功能有關(guān)的膽堿能和單胺能系統(tǒng)的功能,提高學(xué)習(xí)記憶能力。另外,LSPC能顯著減少衰老小鼠腦中作為炎癥因子和與睡眠覺醒有關(guān)的NO的含量,提示LSPC還可能通過改善睡眠改善學(xué)習(xí)記憶功能,這是值得注意的潛在的另一重要機制,關(guān)于這一點尚有待進一步研究。

9、>　　 3.蓮房原花青素對SAMP8學(xué)習(xí)記憶的改善作用及機制的研究
　　 本章是建立在采用化學(xué)損毀模型和D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老模型已證實LSPC能有效改善受損小鼠認(rèn)知功能的基礎(chǔ)上,采用快速老化癡呆模型小鼠SAMP8研究LSPC抗衰老的作用及其機制。SAMP8是快速老化的SAMP(senescence accelerated—prone mouse,SAMP)系中的一個亞系,可作為自然發(fā)病的老化癡呆鼠模型,它們有學(xué)習(xí)記憶功能

10、呈增齡性加速衰退和老年性癡呆的諸多神經(jīng)病理特征,顯示出早期老化和加速老化的特點,主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶障礙,腦內(nèi)β—AP顆粒樣結(jié)構(gòu)廣泛沉著、皮質(zhì)萎縮、海馬錐體細(xì)胞減少等。因此,SAMP8可作為一種比較理想的AD模型,用于對AD具有潛在療效的藥物研究。
　　 為此,選用3月齡的SAMP8作為AD實驗?zāi)Ｐ?同齡的SAMR1為正常對照鼠,給予LSPC60、90、120 mg/kg bw3個月,采用Y迷宮觀察到SAMP8的學(xué)習(xí)記憶功能在6月

11、齡時與SAMR1相比嚴(yán)重受損,但是LSPC能明顯改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。并能抑制6月齡SAMP8腦組織中β-APP的過度表達和5、6月齡SAMP8血清中β-AP含量,降低6月齡SAMP8腦組織和5、6月齡SAMP8血清中MDA和NO含量,降低6月齡SAMP8腦組織中AchE、MAO—B和nNOS活性,5、6月齡SAMP8血清中總NOS活性,同時提高6月齡SAMP8腦組織和5、6月齡SAMP8血清中GSH含量,增強SOD、GSH-Px和a

12、nti-ROS的活性及TAOC,另外LSPC能抑制6月齡SAMP8神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡,Bcl-2的表達量上調(diào)而Bax表達量下調(diào)。這些結(jié)果提示LSPC對SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力的改善機理有四,這些機理在體內(nèi)產(chǎn)生協(xié)同作用。其一,提高體內(nèi)抗氧化酶活性,抑制組織中自由基及其中間有毒產(chǎn)物的產(chǎn)生,抑制細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；其二,增強與認(rèn)知功能有關(guān)的膽堿能和單胺能系統(tǒng)的功能,提高學(xué)習(xí)記憶能力；其三,抑制β-APP和β-AP在體內(nèi)過度表達和生成及其對神經(jīng)細(xì)

13、胞產(chǎn)生神經(jīng)毒作用,讓神經(jīng)細(xì)胞免受損傷；其四,通過調(diào)節(jié)與凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax的表達,來抑制神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 此外,研究還發(fā)現(xiàn),LSPC是從5月齡開始對SAMP8的衰老表現(xiàn)出明顯的抑制作用,到6月齡時顯示出統(tǒng)計學(xué)上有顯著或極顯著性差異的結(jié)果。而且SAMP8在衰老過程中血清中的抗氧化指標(biāo)的變化,同腦組織中抗氧化能力下降十分一致,由此我們認(rèn)為血清中抗氧化指標(biāo)的變化可以作為衰老的一個主要標(biāo)志。
　　 另外需要提及

14、的是,LSPC能顯著減少SAMP8腦中作為炎癥因子和與睡眠覺醒有關(guān)的NO的含量,其結(jié)果與前面完全一致,進一步提示LSPC改善睡眠的作用是其在改善學(xué)習(xí)記憶功能中的一個不可忽視且十分重要的可能因素,這是值得注意的潛在機制,關(guān)于這一點尚待進一步研究和提出更直接的證據(jù)。
　　 4.蓮房原花青素、原花青素B型二聚體與A型二聚體對Aβ1—42誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護作用
　　 采用圓二色譜檢測在37℃孵育0d、3d和7d的Aβ25

15、—35二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),在Aβ25-35中不存在β-折疊結(jié)構(gòu),三者幾乎沒有差異,MTT法結(jié)果顯示孵育7d的Aβ25—35對海馬神經(jīng)細(xì)胞也不產(chǎn)生毒性作用,說明β-折疊結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致Aβ25—35產(chǎn)生聚集的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu),當(dāng)Aβ中不存在β-折疊結(jié)構(gòu)時是不可能發(fā)生聚集的,也就是說β-折疊結(jié)構(gòu)是Aβ對海馬神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的必要結(jié)構(gòu)。為此,后續(xù)的實驗都采用更易聚集的Aβ1-42作為建立神經(jīng)細(xì)胞損傷造模的材料。
　　 利用體外培養(yǎng)SD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞,建

16、立Aβ1-42所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型,MTT實驗發(fā)現(xiàn)5、10μg/mL的LSPC對Aβ1-42導(dǎo)致的海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷有很好的保護作用,通過FCM和TUNEL進一步發(fā)現(xiàn)2.5、5、7.5μg/mL LSPC能抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,可能與LSPC能減少細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的有害產(chǎn)物MDA,提高GSH含量、GSH-PX抗氧化酶活性,增強TAOC和anti—ROS的能力、抑制NF-kB的活化和促凋亡基因P53的表達以及改變細(xì)胞周期分布使

17、細(xì)胞周期阻滯在DNA合成前期即G1期有關(guān)。雖然通過TUNEL發(fā)現(xiàn)相同劑量的A2和B2對Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有一定的改善效果,但效果不及LSPC,且對NF-kB的表達幾乎沒有抑制效果。這一結(jié)果說明,對于天然藥物,并不是單一純品(即使是抗氧化效果最佳的原花青素B2)的效果就是最好,往往活性組分的協(xié)同效應(yīng)顯示了更加顯著地作用。
　　 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),LSPC可以改變細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞凋亡。從FCM檢測細(xì)胞周期的結(jié)果可見,5.0μg

18、/mL LSPC能減少(約5個百分點)細(xì)胞在G1期的分布,同時也能最佳效果地保護Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 綜上所述,LSPC不僅對乙醇和東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶障礙、D-半乳糖致亞急性衰老和快速衰老小鼠SAMP8的學(xué)習(xí)記憶損傷都有很好的改善作用,而且在體外對Aβ1-42誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷也有很好的保護效果。結(jié)果提示,LSPC是一個十分有發(fā)展前景的預(yù)防和治療Alzheimer疾病的天然藥物,其作用機制不僅是通過顯著的抗氧化和