蓮房原花青素對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分：蓮房原花青素對(duì)Aβ25-35所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　目的：
　　以Aβ25-35處理PC12細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，通過(guò)LSPC的干預(yù)，觀察其對(duì)Aβ25-35致細(xì)胞形態(tài)改變、損傷和凋亡情況的保護(hù)效果。
　　方法：
　　（1）Aβ25-35染毒時(shí)間、劑量和蓮房原花青素干預(yù)劑量的確定。
　　將細(xì)胞分為對(duì)照組和Aβ25-35不同劑量組（5、10、20及4

2、0μM），不同組別細(xì)胞分別培養(yǎng)0、6、12、24、48小時(shí)，采用CCK-8法在培養(yǎng)結(jié)束后分別檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，確定最佳染毒時(shí)間和劑量。隨后，使用不同濃度LSPC（1、2.5、5、10、20及40μg/mL）預(yù)孵育細(xì)胞，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，探索其保護(hù)作用及最佳干預(yù)劑量。
　?。?）研究蓮房原花青素對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　細(xì)胞分為5組：對(duì)照組：正常培養(yǎng)；Aβ組：接種24 h后，加入20μM

3、 Aβ25-35繼續(xù)培養(yǎng)24h；LSPC三個(gè)細(xì)胞活性最佳的劑量組（10、20、40μg/mL）：細(xì)胞接種24h后，加入LSPC進(jìn)行30min，再加入Aβ25-35繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞和培養(yǎng)液分別檢測(cè)細(xì)胞LDH釋放量、T-SOD活性及MDA含量。
　?。?）研究蓮房原花青素對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。
　　細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、Aβ組和10μg/mL LSPC組，干預(yù)方式同上。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化通

4、過(guò)倒置顯微鏡觀察；使用Hoechst單染和AnnexinV/PI雙染后，分別使用熒光倒置顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　?。?）與對(duì)照組細(xì)胞相比，不同濃度的Aβ25-35暴露均能夠?qū)е录?xì)胞活性的降低，呈現(xiàn)出一定的時(shí)間-劑量效應(yīng)，細(xì)胞活性的IC50在12h時(shí)約在40μM，24h時(shí)約為20μM，因此選擇低劑量長(zhǎng)時(shí)間暴露的20μM、24h作為染毒劑量和時(shí)間。LSPC的干預(yù)使細(xì)胞有不同程度的升高，在10μg/

5、mL的劑量時(shí)，存活率最高（P<0.05）。
　?。?）與對(duì)照組相比，Aβ25-35的暴露使細(xì)胞內(nèi)T-SOD酶活性降低，而MDA含量和LDH釋放量升高（P<0.05），提示Aβ25-35的暴露可能降低細(xì)胞的抗氧化能力，促進(jìn)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，引起細(xì)胞膜損傷。而不同濃度LSPC的預(yù)處理能夠明顯改善這些損傷作用，表現(xiàn)為10μg/mL組降低MDA和LDH釋放量的作用均好于20、40μg/mL組，而40μg/mL LSPC提高T-SOD的作

6、用強(qiáng)于10、20μg/mL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，LSPC的預(yù)處理能夠改善Aβ25-35的暴露造成的細(xì)胞數(shù)量降低，細(xì)胞形態(tài)變圓及細(xì)胞突起退化回縮等情況；Hoechst染色后在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)Aβ組凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，而LSPC組中細(xì)胞凋亡減少；流式檢測(cè)凋亡率的結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞總凋亡率一般不超過(guò)5％，而Aβ25-35的暴露使細(xì)胞總凋亡率顯著升高，達(dá)到（33.36±3.05）%，而L

7、SPC組細(xì)胞總凋亡率顯著低于Aβ組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　在本實(shí)驗(yàn)研究條件下，Aβ25-35的暴露可以導(dǎo)致PC12細(xì)胞受損，使其形態(tài)發(fā)生改變，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而LSPC的預(yù)孵育能夠改善Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。
　　第二部分：蓮房原花青素對(duì)PC12細(xì)胞中CREB/BDNF表達(dá)的影響及其機(jī)制的研究。
　　目的：
　　通過(guò)檢測(cè)各組細(xì)胞中CREB/BDNF的表達(dá)情況以及其上游PI3K/AKT

8、和Raf/ERK1/2信號(hào)通路的激活情況，探索LSPC對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用的具體機(jī)制。
　　方法：
　　細(xì)胞分為：對(duì)照組、Aβ組、LSPC組（干預(yù)方式同第一部分）；抑制劑組（LY-特異性AKT通路抑制劑組、PD-特異性ERK通路抑制劑組）：接種后24h換液，加入抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞；抑制劑+LSPC組：細(xì)胞24h，換液后加入10μg/mL LSPC預(yù)處理30min后，加入相應(yīng)的抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。細(xì)胞中B

9、DNF蛋白表達(dá)、CREB磷酸化程度以及上游AKT和ERK1/2活化程度使用Western blot法分別檢測(cè)，BDNF mRNA的表達(dá)量使用Real time PCR法檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　與對(duì)照組比較，Aβ組BDNF蛋白和mRNA的表達(dá)量均有降低，其基因的調(diào)節(jié)蛋白CREB的活化程度也相應(yīng)降低，其上游蛋白P-AKT和P-ERK1/2蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有顯著性（P<0.05）；與Aβ組相比，LSPC的預(yù)處理顯著增加了BDNF

10、的表達(dá)，P-CREB、P-AKT和P-ERK1/2表達(dá)升高（P<0.05）；相對(duì)于抑制劑組，LSPC組的預(yù)處理可以部分改善其對(duì)相應(yīng)蛋白的抑制作用，差異有顯著性（P<0.05），表明LSPC能夠通過(guò)這兩條通路調(diào)節(jié)CREB/BDNF通路。
　　結(jié)論：
　　1、在本實(shí)驗(yàn)研究條件下，Aβ25-35的暴露能夠下調(diào)PC12細(xì)胞中CREB的活化，降低BDNF表達(dá)水平，LSPC的預(yù)孵育能改善上述蛋白的表達(dá)。
　　2、抑制劑和LSPC的

11、聯(lián)合作用的結(jié)果表明，LSPC可能通過(guò)上調(diào)P-AKT和P-ERK1/2的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)CREB/BDNF的活化，發(fā)揮其保護(hù)作用。
　　第三部分：蓮房原花青素對(duì)PC12細(xì)胞中PERK/eIF2α表達(dá)的影響及其機(jī)制的研究。
　　目的：
　　通過(guò)檢測(cè)各組細(xì)胞中PERK/eIF2α的激活情況，探索LSPC對(duì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的改善，并通過(guò)CHOP/Caspase-3凋亡通路的檢測(cè)和GSK-3β、Tau蛋白磷酸化程度的變化，進(jìn)一步研究

12、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷及LSPC的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　細(xì)胞分為：對(duì)照組、Aβ組、LSPC組（干預(yù)方式同第一部分）；GSK組：細(xì)胞接種后，培養(yǎng)24h，換液后加入0.5mM GSK2606414（特異性PERK抑制劑），繼續(xù)培養(yǎng)；Aβ+GSK組：GSK2606414預(yù)孵育，30min后加入Aβ，24h后收集細(xì)胞。LSPC＋GSK組：提前加入10μg/mL LSPC及GSK2606414預(yù)孵育30min，加入Aβ，24h后

13、收集細(xì)胞。細(xì)胞中PERK/eIF2α的磷酸化程度，以及CHOP/Caspase-3凋亡通路的檢測(cè)和GSK-3β、Tau的磷酸化使用Western blot法分別檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　與對(duì)照組比較，Aβ組的PERK和eIF2α的磷酸化程度明顯升高，該通路被活化，差異有顯著性（P<0.05）；與Aβ組相比，LSPC的預(yù)處理顯著降低了兩種蛋白磷酸化形式的表達(dá)，差異有顯著性（P<0.05）；加入GSK抑制劑后，該通路被抑制，而加入

14、Aβ之后，P-PERK和P-eIF2α的表達(dá)相對(duì)于抑制劑組有所上升，表明Aβ可能部分激活了PERK/eIF2α通路的活化，引起了細(xì)胞內(nèi)的ERS；而LSPC和PERK抑制劑的聯(lián)用明顯降低了P-PERK和P-eIF2α表達(dá)，差異有顯著性（P<0.05）。此外，CHOP/Caspase-3通路以及P-GSK-3β、P-Tau蛋白的表達(dá)量與P-PERK、P-eIF2α的變化趨勢(shì)一致。
　　結(jié)論：
　　1．在本研究實(shí)驗(yàn)條件下，Aβ25