鷹嘴豆芽素A對Aβ25-35誘導神經損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、目的：阿爾茨海默?。ˋlzheimer’sdisease，AD），以其發(fā)現(xiàn)者（AloisAlzheimer）命名的，是一種主要影響老年人的神經退行性疾病，其特點是逐步惡化的記憶、認知和行為，是世界范圍內造成癡呆的主要原因，據(jù)估計，到2050年將有1.154億人罹患AD。β-淀粉樣肽（β-amyloid，Aβ）沉積是大多數(shù)學者認可的AD發(fā)病機制之一。Aβ通過引起線粒體功能損傷，引起氧化應激反應和鈣離子超載，導致細胞色素C的釋放和半胱胺酸天

2、冬氨酸蛋白酶的活化，從而啟動神經元的凋亡。鷹嘴豆芽素A（BiochaninA），是甲基化的天然異黃酮類化合物，屬于植物雌激素，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等性質。研究顯示，鷹嘴豆芽素A對單方面注入脂多糖誘導的帕金森大鼠模型具有保護作用，在腦缺血再灌注模型中具有神經保護作用，然而鷹嘴豆芽素A對AD模型中神經損傷的保護作用研究較少，機制尚不明確。本研究采用Aβ活性片斷Aβ25-35建立AD細胞模型、AD大鼠模型，檢測BiochaninA對AD模

3、型下的神經元及大鼠的保護作用，并進一步探討B(tài)iochaninA神經保護作用的機制。
　　方法：
　　1、大鼠大腦皮質原代神經元培養(yǎng)
　　取新生24h內SD大鼠，無菌條件下取腦皮質部分，經胰酶消化成單細胞懸液，過濾后接種于用多聚賴氨酸預先包被的培養(yǎng)板中，置于5％CO2及飽和濕度的37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h后首次換液為含2%B27的neurobasal完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后半量換液為含有阿糖胞苷的neurobasa

4、l完全培養(yǎng)基，48h后完全換液去除阿糖胞苷，以后每隔2d半量換液。神經元培養(yǎng)七天即可用于實驗。
　　2、AD大鼠模型的制備
　　大鼠經腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，將其固定于腦立體定位儀，沿顱骨中線切開皮膚，暴露出前囟位置。參考圖譜中所描述的海馬CA1區(qū)位置，根據(jù)動物實際大小稍作調整，距前囟向后3.5mm，距中線左右各2.0mm處，開直徑為1mm的骨窗，微量注射器垂直顱骨表面進針3.5mm，緩慢注入5μLAβ25-35溶液，

5、留針10min，緩慢撤針，縫合。
　　3、凝聚態(tài)Aβ25-35的制備
　　在無菌條件下將2mgAβ25-35粉末溶解于1ml滅菌注射用水中，分裝后在37℃放置72h使其老化后，將其儲存于-20℃冰箱中備用。
　　4、實驗分組與給藥
　　4.1Aβ25-35損傷大鼠神經元細胞模型的制備
　　新生1d內的SD大鼠，取皮層部位進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)至神經元成熟以后（7d），經Aβ25-35處理，隨機分為control

6、組、Aβ25-35組（Aβ25-35濃度分別為10、20、40μM），處理24h，檢測細胞的存活率。
　　4.2鷹嘴豆芽素A對神經元存活率的影響
　　新生1d內SD乳鼠，取皮層部位進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)至神經元成熟以后，經BiochaninA處理，隨機分為control組、BiochaninA組（BiochaninA濃度分別為0.5、1、2.5、5、10、20μM），處理24h，檢測細胞的存活率。
　　4.3鷹嘴豆芽素A對

7、Aβ25-35所致神經元損傷的影響
　　培養(yǎng)7d的皮層神經元，隨機分組后分別加入不同濃度BiochaninA（0.2、1、5、10μM）與Aβ25-35（20μM），BiochaninA加入6h后加入Aβ25-35，處理24h，MTT法檢測細胞活性。
　　4.4Aβ25-35對SD大鼠行為學的影響
　　將30只體重180-200g雄性Spague-Dawley（SD）大鼠隨機分為3組（假手術組、溶劑對照組（假手術+蒸餾

8、水）、以及Aβ25-35損傷組），每組10只。術后7d-12d進行Morris水迷宮行為學測試。
　　4.5鷹嘴豆芽素A對Aβ25-35損傷大鼠行為學的影響
　　將70只體重180-200g雄性Spague-Dawley（SD）大鼠隨機分為7組：假手術組、模型組、溶劑對照組、低濃度組（模型組+10mg/kg）、中濃度組（模型組+20mg/kg）、高濃度組（模型組+40mg/kg）、雌二醇對照組（模型組+雌二醇）。模型制備方法

9、同第一部分，BiochaninA保護組于術后2周腹腔注射不同劑量的BiochaninA。溶劑對照組大鼠注射與高濃度組等體積的DMSO。BiochaninA注射2周后進行行為學測試。4.6雌激素受體抑制劑對鷹嘴豆芽素A的神經保護作用的影響
　　取培養(yǎng)7d的神經元細胞，隨機分為control組、Aβ25-35（20μM）組、BiochaninA保護組（20μMAβ25-35+1μMBiochaninA）、雌激素受體抑制劑阻斷Bioch

10、aninA組（20μMAβ25-35+1μMBiochaninA+10μMICI182780）、E2保護組（20μMAβ25-35+100nME2）、雌激素受體抑制劑阻斷E2組（20μMAβ25-35+100nME2+10μMICI182780）。采用Westernblot法觀察雌激素受體抑制劑（ICI182780）干預BiochaninA對Aβ25-35誘導的神經元caspase-3表達水平的影響。
　　4.7鷹嘴豆芽素A對神經

11、元內MAPK家族蛋白的影響
　　取培養(yǎng)7d的神經元細胞，隨機分為control組、Aβ25-35（20μM）組、BiochaninA保護組（20μMAβ25-35+1μMBiochaninA）。采用Westernblot法觀察BiochaninA對Aβ25-35誘導的神經元MAPK家族蛋白表達水平的影響。
　　4.8鷹嘴豆芽素A及p38MAPK抑制劑SB202190對凋亡蛋白家族的caspase-3、Bcl-2、Bax、gr

12、p78及p38通路的影響
　　取培養(yǎng)7d的神經元細胞，隨機分為control組、Aβ25-35（20μM）組、BiochaninA保護組（20μMAβ25-35+1μMBiochaninA）、p38MAPK抑制劑阻斷組（20μMAβ25-35+10μMSB202190）、p38MAPK抑制劑組（10μMSB202190）、雌二醇保護組（20μMAβ25-35+100nME2）。采用Westernblot法觀察p38MAPK抑制劑（

13、SB202190）對Aβ25-35誘導的神經元caspase-3、Bcl-2、Bax、grp78、P-p38、ATF2表達水平的影響。
　　5、MTT法檢測細胞存活率
　　細胞接種于24孔板，加藥處理24h后，每孔加入20μLMTT液（3.6mmol·L-1），37℃孵育4h，棄上清，加入500μLDMSO，使甲瓚結晶溶解。酶標儀測定570nm處的吸光度值，每組設6個復孔。
　　6、WesternBlot分析
　

14、　取分組加藥處理后神經元細胞，冰上操作，提取細胞蛋白，蛋白提取液與上樣緩沖液混合，煮沸變性。SDS-PAGE電泳使蛋白樣品分離，100mA恒流轉膜，脫脂奶粉室溫封閉2h以上，一抗4℃過夜，TBST漂洗30min后加二抗室溫孵育2h，TBST漂洗30min，暗盒中加ECL發(fā)光試劑顯色，暗室中壓X光片顯影。X-光膠片經掃描，應用ImageJ圖像分析軟件對掃描圖上的條帶進行相對定量分析。
　　7、Morris水迷宮行為學測試
　　

15、提前1h將SD大鼠放置于行為學測試房間內，使其適應環(huán)境。行為學測試于每天9:30開始，室溫25℃，水溫20℃-22℃，Morris水迷宮行為學測試歷時6天，前5天進行定位航行實驗，每天訓練4次。大鼠入水至尋找到平臺所需時間為逃避潛伏期（escapelatency）。第6天為空間探索實驗，撤去平臺，將大鼠從與平臺所在象限相對的象限面壁放入水中，記錄大鼠90s內穿越平臺區(qū)的次數(shù)（numberofplatformcrossings）以及大鼠在

16、平臺所屬象限（第一象限）停留的時間百分比（Ⅰtimeratio）等行為學指標。
　　8、數(shù)據(jù)處理
　　上述實驗均重復三次，所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，數(shù)據(jù)經SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，采用單因素方差分析（onewayANOVA）繼以student’sttest對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結果以P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、BiochaninA對Aβ25-35所致原代培養(yǎng)皮質

17、神經元損傷的作用
　　1.1Aβ25-35建立AD細胞模型
　　MTT法檢測結果顯示，與溶劑對照組相比，10、20、40μmol/LAβ25-35作用于大鼠皮質神經元24h后均可致神經元細胞的存活率降低，而20μMAβ25-35作用24h后，細胞的存活率為溶劑對照組的（62.55±0.01）%（P＜0.05）在上述濃度范圍內，根據(jù)Aβ25-35的毒性，選擇20μmol/LAβ25-35處理24h建立AD細胞模型。
　　

18、1.2BiochaninA對神經元存活率的影響
　　MTT法檢測結果顯示，與溶劑對照組相比，0.5、1、2.5、5、10、20μmol/L的鷹嘴豆芽素A作用于大鼠皮質神經元24h后細胞存活率沒有明顯變化。
　　1.3BiochaninA對Aβ25-35所致神經元損傷的作用
　　MTT法檢測結果顯示，與對照組相比，1μmol/L鷹嘴豆芽素A對Aβ25-35處理24h后，顯示出最大的保護作用，其存活率為Aβ25-35損傷組

19、組的125.8%（P＜0.05）。
　　2、BiochaninA對AD大鼠模型的影響
　　2.1Aβ25-35對大鼠空間學習記憶能力的影響
　　Morris水迷宮測試結果顯示，定位航行實驗期間每一組大鼠的逃避潛伏期全部隨學習天數(shù)的逐漸增加而縮短；三組大鼠每天平均游泳速度無統(tǒng)計學差異；相比于溶劑對照組大鼠，模型組大鼠逃避潛伏期顯著增加（P＜0.05），而假手術組大鼠的學習成績與溶劑對照組大鼠無統(tǒng)計學差異。
　　空間

20、探索實驗期間假手術組大鼠穿越平臺區(qū)的次數(shù)與溶劑對照組大鼠無統(tǒng)計學差異，假手術組大鼠與溶劑對照組大鼠在平臺所在象限停留時間百分比無統(tǒng)計學差異。與溶劑對照組相比，Aβ25-35組大鼠穿越平臺區(qū)的次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。與溶劑對照組相比，Aβ25-35組大鼠在平臺所在象限停留時間百分比顯著減少（P＜0.05）。
　　2.2BiochaninA對Aβ25-35損傷大鼠空間學習記憶的影響
　　Morris水迷宮行為學測試結果顯示

21、，定位航行實驗期間各組大鼠的逃避潛伏期全部隨學習天數(shù)的增加而逐漸縮短；七組大鼠每天平均游速無統(tǒng)計學差異；相比于溶劑對照組，雌二醇組部分逆轉Aβ25-35損傷引起的逃避潛伏期增加，鷹嘴豆芽素A能夠改善Aβ25-35損傷引起的逃避潛伏期增加，且作用呈濃度依賴性?？臻g探索實驗結果顯示，鷹嘴豆芽素A能夠改善Aβ25-35損傷大鼠平臺區(qū)穿越次數(shù)減少及在平臺所在象限停留時間百分比減少的現(xiàn)象，且作用呈濃度依賴性。
　　3、雌激素受體抑制劑對Bi

22、ochaninA的神經保護作用的影響
　　Westernblot結果顯示，與鷹嘴豆芽素A保護組（20μMAβ25-35+1μMBiochaninA）相比ICI182780處理組（20μMAβ25-35+1μMBiochaninA+ICI182780）caspase-3蛋白水平明顯增加（P＜0.05）。
　　4、BiochaninA對神經元內MAPK家族蛋白的影響
　　Westernblot結果顯示，與control組相

23、比Aβ25-35損傷組P-JNK、P-p38的表達增加，P-ERK的表達降低（P＜0.05）。與Aβ25-35損傷組相比，鷹嘴豆芽素A保護組P-p38蛋白水平降低（P＜0.05），而P-JNK、P-ERK沒有明顯變化。
　　5、BiochaninA及p38MAPK抑制劑SB202190對凋亡蛋白家族的caspase-3、Bcl-2、Bax、grp78以及p38信號通路的影響
　　Westernblot結果顯示，與Aβ25-3

24、5損傷組相比，鷹嘴豆芽素A保護組與p38MAPK抑制劑處理組caspase-3蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。與Aβ25-35損傷組相比，鷹嘴豆芽素A保護組與p38MAPK抑制劑處理組Bax/Bcl-2比值明顯降低（P＜0.05）。
　　Westernblot結果顯示，與Aβ25-35組相比，鷹嘴豆芽素A組與p38MAPK抑制劑處理組P-p38、ATF2蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。與control組相比，Aβ25-35損傷

25、組grp78蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。鷹嘴豆芽素A保護組能明顯抑制Aβ25-35引起的grp78蛋白水平升高（P＜0.05）。Aβ25-35+SB202190組與單加SB202190組grp78蛋白水平與Aβ25-35組相比沒有明顯降低。
　　結論：
　　1、BiochaninA能對抗Aβ25-35誘導的神經元損傷，對Aβ25-35損傷大鼠空間學習記憶具有改善作用。
　　2、BiochaninA能對抗Aβ25-