Aβ25-35對(duì)大鼠腦神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)又稱老年性癡呆,是一種以臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、記憶力及生活能力減退為主的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。盡管 AD發(fā)病機(jī)制目前還不十分明確,但β淀粉樣蛋白(amyloid beta-protein,Aβ)作為AD發(fā)病的始動(dòng)因子已得到廣泛認(rèn)可。目前對(duì)Aβ引起AD的機(jī)制研究主要集中在炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡及氧化應(yīng)激。
　　自1970年以來(lái),人們逐漸發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia

2、,MG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞,在機(jī)體固有免疫及多種神經(jīng)退行性疾病的炎癥反應(yīng)中承擔(dān)重要作用。近年來(lái)相關(guān)研究表明,MG在AD神經(jīng)病理變化中起著“雙刃劍”的作用。一方面,活化的MG可以通過(guò)吞噬作用清除β淀粉樣蛋白,從而降低 Aβ對(duì)神經(jīng)元的毒性作用;另一方面,過(guò)度活化的MG可產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì),如IL-1β、TNF-α等,這些炎性介質(zhì)誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)的形成,進(jìn)而加速AD病程的發(fā)展和惡化。因此,本課題從整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)觀察大鼠海馬注射 A

3、β不同時(shí)間段后神經(jīng)元損傷情況、Aβ沉積量及MG活化量,著重分析Aβ沉積、神經(jīng)元損傷與MG的激活三者之間的關(guān)系;另有研究表明,Aβ通過(guò)加重大鼠海馬神經(jīng)元凋亡誘發(fā)神經(jīng)毒性作用,Aβ對(duì)在體及體外的神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用依賴于其聚集狀態(tài)與濃度,為進(jìn)一步分析其作用機(jī)制,本課題離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體外PC12細(xì)胞培養(yǎng),經(jīng)不同濃度凝聚態(tài)Aβ處理后,采用MTT、Hoechst33258染色、免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫印跡方法,比較分析Aβ對(duì)PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影

4、響。
　　第一部分β淀粉樣蛋白對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞的影響
　　目的:
　　探討雙側(cè)海馬注射 Aβ25-35后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞的影響,分析Aβ對(duì)神經(jīng)元的作用、Aβ沉積和MG激活的關(guān)系。
　　方法:
　　1實(shí)驗(yàn)分組及處理:實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組和Aβ處理組(4個(gè)時(shí)間點(diǎn)),每組8只,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。正常對(duì)照組注射無(wú)菌生理鹽水5μl,Aβ處理組注射凝聚態(tài)Aβ25-355μl(10μg)。A

5、β處理組按照注射Aβ25-35后不同時(shí)間2、7、15、21天處死分為4組。
　　2 AD模型制備:海馬區(qū)定位坐標(biāo):AP-3.5mm,ML±2.0mm,DV2.7mm。雙側(cè)用微量注射器分別注入5μl凝聚態(tài)Aβ25-3510min注完,留針5min。
　　3 Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn):水池注水至水面高于平臺(tái)1.5cm,維持水溫(21±1)℃,加入墨汁攪勻,確保大鼠不會(huì)看見(jiàn)平臺(tái);實(shí)驗(yàn)期間迷宮周圍參照物不變,自動(dòng)攝像機(jī)同步記錄大

6、鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。注射 Aβ7天后開始實(shí)驗(yàn),第1-2天為訓(xùn)練,第3-5天數(shù)據(jù)作為學(xué)習(xí)、記憶成績(jī),第6天撤去平臺(tái),觀察大鼠2分鐘內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)。
　　4標(biāo)本處理:大鼠麻醉灌注后,取腦組織固定24h后石蠟包埋,行冠狀切片,5μm厚,含海馬部位,以備進(jìn)行硫堇染色和Aβ、CD11b(染MG)免疫組化。
　　5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　1 Aβ對(duì)大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響:對(duì)照組大鼠

7、第3,4,5天尋找平臺(tái)的潛伏期分別為13.57,8.68,7.09秒,15天和21天Aβ處理組大鼠3天的潛伏期明顯比對(duì)照組長(zhǎng)(P<0.05)。對(duì)照組大鼠2分鐘內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)為11.13次,15天和21天Aβ處理組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)為分別為4.25、4.38次,較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)。
　　2 Aβ對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的影響:硫堇染色顯示,對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞帶完整,細(xì)胞排列整齊有序,細(xì)胞形態(tài)正常,胞核不著色,胞漿尼氏體著

8、色深,未見(jiàn)神經(jīng)元缺失和膠質(zhì)細(xì)胞增生。Aβ處理組大鼠從注射Aβ2天至7天、15天細(xì)胞損傷逐漸加重,膠質(zhì)細(xì)胞增多,至21天,細(xì)胞損傷較15天有緩和現(xiàn)象,膠質(zhì)細(xì)胞減少。
　　3海馬CA1區(qū)Aβ25-35沉積和MG的變化
　　Aβ免疫組化顯示模型組大鼠Aβ沉積量在2-7天穩(wěn)定并達(dá)最高值,之后呈下降趨勢(shì)。CD11b免疫組化顯示,MG分布部位與Aβ沉積部位相似。與對(duì)照組相比,Aβ處理組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)MG的形態(tài)和活化量都有顯著差異(P<0.0

9、5),Aβ處理組2天和7天MG活化量達(dá)最多,兩組無(wú)顯著差異(P>0.05),但其后MG活化量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。
　　結(jié)論:
　　Aβ可以引起神經(jīng)元損傷,降低大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力;Aβ可以激活MG,引起 MG形態(tài)和數(shù)量改變,募集活化的MG到 Aβ沉積部位,MG可吞噬、清除Aβ;Aβ沉積量和MG活化數(shù)量變化呈正相關(guān)。
　　第二部分Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　目的:
　　觀察不同濃度

10、(0.1、1、2、5、10、20μmol/L)Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　方法:
　　采用不同濃度的Aβ25-35與PC12細(xì)胞共孵育48h后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性,Hoechst33258核染色形態(tài)學(xué)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2,Bax,Caspase-3表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　MTT檢測(cè)顯示 Aβ25-35抑制細(xì)胞生長(zhǎng)活性呈濃度依賴性,A

11、β25-35對(duì)PC12細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)活性抑制作用隨 Aβ25-35濃度的增大而加強(qiáng);Hoechst33258染色顯示Aβ25-35與PC12細(xì)胞凋亡呈濃度依賴性關(guān)系;免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫印跡檢測(cè)結(jié)果均顯示Bcl-2蛋白表達(dá)量隨Aβ25-35濃度的增大呈下降趨勢(shì),Bax,Caspase-3蛋白表達(dá)量隨 Aβ25-35濃度的增大呈上升趨勢(shì)。
　　結(jié)論:
　　Aβ25-35可致PC12細(xì)胞凋亡,其機(jī)制與下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)