Aβ42及CD40L對原代小膠質(zhì)細(xì)胞活化及神經(jīng)元的作用研究.pdf

1、阿爾茨海默?。╝lzheimer'sdisease,AD）是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙、行為異常為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。據(jù)最新研究發(fā)現(xiàn)我國≥65歲AD總患病率為5.8％（歐美為6.4％），85歲以上患病率為1/3。AD的發(fā)病率高于VD等其他類型的癡呆，并與年齡成正相關(guān)。據(jù)2005年統(tǒng)計全球有2430萬癡呆患者，每年新增460萬，每7秒全球新增1例患者。2010年世界范圍內(nèi)的癡呆花費約為6040億美元。癡呆給社會和家庭帶來了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)

2、。據(jù)統(tǒng)計，老年性癡呆約占老年病死亡原因的第四位，僅次于心腦血管病和癌癥。一般AD診斷后存活期在5～20年，目前尚無行之有效的治療方法，早期診斷及治療可以改善癥狀、延緩病程的進(jìn)展、提高病人的生活質(zhì)量，減輕社會及家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　 AD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，近來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子受體超家族成員CD40與其同源配體CD40L與AD的病理機(jī)制關(guān)系密切。目前國內(nèi)對CD40-CD40L通路的研究主要限于冠心病、腦血管病、高血壓等血管損傷方

3、面，而國外對該通路與AD的病理機(jī)制、診斷及治療方面研究的較多。CD40-CD40L可以影響Aβ的產(chǎn)生及清除，影響Tau蛋白磷酸化，亦可以通過Aβ纖維體誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨a(chǎn)生的固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答加重神經(jīng)炎癥反應(yīng)，多種途徑啟動并促進(jìn)AD的病理機(jī)制的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)一步加重神經(jīng)元損傷，阻斷該通路可以減輕AD病理損傷。在PSAPP或TgAPPsw轉(zhuǎn)基因鼠/CD40L基因缺陷鼠發(fā)現(xiàn)阻斷CD40-CD40L可以降低Aβ誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，減輕神

4、經(jīng)元損傷。
　　 目前認(rèn)為Aβ1-42寡聚體對神經(jīng)元的毒性作用最強(qiáng)，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)方面是否也是最強(qiáng)尚不清楚，本實驗通過體外建立AD的炎性反應(yīng)模型，用不同濃度的Aβ1-42單體、寡聚體及纖維體分別干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞，檢測炎癥指標(biāo)的強(qiáng)弱及神經(jīng)元損傷情況。通過Aβ1-42寡聚體單獨或聯(lián)合CD40L分別干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞，并予抗CD40抗體阻斷CD40-CD40L信號通路后，檢測各組的炎癥反應(yīng)情況及對神經(jīng)元的影響，探討CD40-CD

5、40L信號在Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用，尋找治療AD的可能的靶點，為后續(xù)試驗提供理論依據(jù)。
　　 [材料和方法]:
　　 1.材料:昆明乳鼠（3天以內(nèi)）購自中山大學(xué)實驗動物中心(許可證號:SCXK(粵)2009-0011），澳洲胎牛血清(GIBCO)，DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(GIBCO)，神經(jīng)元無血清培養(yǎng)基(Neurobasal，GIBCO)，B27神經(jīng)營養(yǎng)因子(GIBCO)，胰酶（含EDTA，0.2

6、5％，吉諾），多聚L-賴氨酸(Sigma)，青鏈霉素（雙抗，Sigma），二甲基亞砜(DMSO，MPBiomedicats)，六氟異丙醇(HFIP,Sigma)，大鼠抗小鼠FITC標(biāo)記的CD11b(OX42，eBioscience)，雞抗小鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE多克隆抗體(Millipore)，辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合羊抗雞抗體(SantaCruzBiotechnology)，DAB試劑盒(SantaCruz)，人工合成的生物

7、晶體Aβ1-42(Sigma)，CD40Ligand(eBioscience)，CD40抗體(eBioscience)，IFN-γ(eBioscience)FITC-大鼠抗小鼠CD40抗體(eBioscience)，F(xiàn)ITC-大鼠抗小鼠CD45抗體(BD，61008)，PE-大鼠抗小鼠MHCⅡ抗體(eBioscience)，同型對照(eBioscience)，小鼠TNF-αELLSA試劑盒（達(dá)科為生物科技有限公司），小鼠LDH試劑盒（博

8、泰生物科技有限公司）儀器:超凈工作臺(中國，AIRTECH)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國，ThermoFoma)、倒置顯微鏡（日本，OLYMAPUS）、流式細(xì)胞分析儀(德國，BectonDickinson)，透射電鏡(荷蘭PhilipsCM10)，低溫高速離心機(jī)(德國，Beckman)，SynerTMHT多通道酶標(biāo)儀(美國，BIOTEK)，消毒手術(shù)器械
　　 2.方法:
　　 2.1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 2.1.1.原代小膠質(zhì)

9、細(xì)胞培養(yǎng):新生乳鼠無菌條件下取出大腦皮質(zhì)，放入預(yù)D-Hanks液清洗2次，小心剝離腦膜和血管，0.125％的胰酶消化37℃，15min，終止后過濾，離心，計數(shù)，接種（DMEM/F12高糖培養(yǎng)基，含1％青、鏈霉素、20％胎牛血清）。24小時后全量換液、之后三天換液一次，至7-9天膠質(zhì)細(xì)胞分層。上層細(xì)胞為圓形或橢圓，主要是小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，下層細(xì)胞連成片主要是神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞。輕輕搖晃培養(yǎng)瓶5min，收集上層細(xì)胞，半小時內(nèi)差速貼

10、壁法進(jìn)一步純化小膠質(zhì)細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD11b，陽性率大于95％，可以用于實驗。
　　 2.1.2.原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng):取材接種同原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，不同的是第二天更換無血清神經(jīng)元培養(yǎng)基（含1％青、鏈霉素，含2％B27神經(jīng)營養(yǎng)因子），三天一次換液，4-5天左右形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，五個顯微鏡視野下，平均每個視野棕黃色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的90％以上。
　　 2.2.Aβ1-42寡聚體

11、、纖維體、單體制作:將人工合成的Aβ1-42晶體0.5mg用六氟異丙醇(HFIP)0.11ml溶解、重懸。室溫條件下在通風(fēng)櫥內(nèi)使HFIP揮發(fā)，Aβ1-42形成白色肽膜。然后用20ul二甲基亞楓DMSO溶解，稀釋分裝。4℃、24小時后即為Aβ42寡聚體;37℃、7天后即為Aβ1-42纖維體;而溶解好的Aβ1-42單體直接保存在-20℃?zhèn)溆?。?ul上述液體滴于含碳支持膜200目去離子銅網(wǎng)上，空氣干燥1分鐘后，用2％醋酸雙氧鈾負(fù)染1分鐘，使

12、用透射電鏡鑒定。
　　 2.3.小膠質(zhì)細(xì)胞炎性模型建立:
　　 2.3.1.不同濃度的Aβ1-42單體、寡聚體、纖維體對小膠質(zhì)細(xì)胞的致炎作用比較:將分離純化的原代小膠質(zhì)細(xì)胞以1×105/孔接種到六孔板中24h，分別將濃度為1ug/ml，5ug/ml，10ug/ml的Aβ1-42寡聚體及纖維體加入小膠質(zhì)細(xì)胞，設(shè)立對照組，與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，分別收集上清液及細(xì)胞，并用夾心ELISA法檢測上清液中的TNF-α，取濃度為

13、5ug/mlAβ1-42寡聚體及纖維體干預(yù)過的小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD45及MHCⅡ分子。
　　 2.3.2.將分離純化的小膠質(zhì)細(xì)胞以1×105/孔接種到六孔板中，采取濃度為5ug/ml的Aβ1-42寡聚體單獨及聯(lián)合2ug/mlCD40L干預(yù)組、T細(xì)胞參與的適應(yīng)性免疫應(yīng)答產(chǎn)物之一γ干擾素（IFN-γ）10ug/ml聯(lián)合Aβ1-42組，并設(shè)立對照，培養(yǎng)24h后檢測小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α釋放水平及向抗原提呈功能

14、轉(zhuǎn)化情況;將干預(yù)過的小膠質(zhì)細(xì)胞上清液繼續(xù)培養(yǎng)神經(jīng)元同時將不同干預(yù)條件直接培養(yǎng)神經(jīng)元，分別培養(yǎng)24h檢測神經(jīng)元乳酸脫氫酶(LDH)的釋放水平來觀察神經(jīng)元的損傷，隨后用2.5ug/ml抗CD40抗體阻斷CD40-CD40L通路后，繼續(xù)觀察以上指標(biāo)的變化。檢測各實驗組小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥上清液TNF-α及神經(jīng)元上清的LDH水平:嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD40及MHCⅡ表達(dá)。
　　 3.統(tǒng)計學(xué)處

15、理
　　 計量資料均采用結(jié)果用(x)±s表示，應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用析因設(shè)計的方差分析及單因素方差分析(One-wayANOVA)方法，方差齊性用LSD法，方差不齊用Dunnett'sT3法進(jìn)行組間多重比較，p＜0.05被定為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]:
　　 1.原代小膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定:倒置顯微鏡下可見小膠質(zhì)細(xì)胞胞體圓形或橢圓形，伸出突起，多而短，也可見細(xì)長突起，活化后呈阿米巴樣;

16、流式細(xì)胞術(shù)鑒定純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞，表面CD11b的陽性率在95％以上。
　　 2.原代神經(jīng)元細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定:無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)混合細(xì)胞4-5天后，膠質(zhì)細(xì)胞因無血清而生長受抑制，神經(jīng)元開始生長，并被培養(yǎng)基篩選為主要細(xì)胞，逐漸伸出軸突樹突并開始形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見細(xì)胞為棕褐色，陽性率為90％以上。
　　 3.不同形式的Aβ1-42的制作:制作成功的Aβ1-42寡聚體在透射電鏡下顯示為圓形或橢圓形的立體結(jié)構(gòu)，長

17、度、寬度及高度一般在10nm左右;纖維體為針狀縱橫交錯的淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)。
　　 4.各組小膠質(zhì)細(xì)胞上清液TNF-α的濃度比較:
　　 4.1.不同濃度及形式的Aβ1-42對小膠質(zhì)細(xì)胞的致炎作用比較:濃度為1ug/ml，5ug/ml，10ug/ml的Aβ1-42單體、寡聚體及纖維體對小膠質(zhì)細(xì)胞干預(yù)24h后，各組上清液TNF-α濃度較對照組比較明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各實驗組比較，濃度5ug/ml的Aβ1-

18、42干預(yù)組TNF-α釋放較其他濃度組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。寡聚體組較單體及纖維體組上清TNF-α釋放增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.2.CD40L對Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的致炎作用比較:各組上清液TNF-α濃度比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。加入CD40L或IFN-γ后與Aβ1-42寡聚體單獨干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞比較，上清液中TNF-α釋放明顯增加，加入抗CD40抗體阻斷后

19、，發(fā)現(xiàn)上清TNF-α釋放減少，各組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5.各組小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD45、CD40及MHCⅡ分子表達(dá)情況比較:
　　 5.1.不同形式的Aβ1-42小膠質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)情況比較:濃度為5ug/mlAβ1-42寡聚體及纖維體干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD45及MHCⅡ分子，寡聚體組較纖維體組，細(xì)胞表面的CD45及MHCⅡ表達(dá)更明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

20、
　　 5.2.CD40L對Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞表面抗原的影響:加入CD40L后小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD40及MHCⅡ分子共表達(dá)陽性率比單獨Aβ1-42干預(yù)組高;加入抗CD40抗體后，二者的共表達(dá)陽性率較Aβ1-42單獨及聯(lián)合CD40L干預(yù)組下降。各實驗組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6.各組神經(jīng)元細(xì)胞上清液LDH的濃度比較:
　　 6.1.不同濃度及形式的Aβ1-42對神經(jīng)元的作用比較:

21、濃度為1ug/ml，5ug/ml，10ug/ml的Aβ1-42單體、寡聚體及纖維體直接作用于神經(jīng)元24h后，ELLSA檢測各組上清液中LDH的釋放，濃度為5ug/ml不同形式的Aβ1-42干預(yù)組與其他濃度比較，LDH釋放明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。寡聚體干預(yù)組LDH釋放增多最明顯，其次是纖維體，各組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。6.2各組CD40L及Aβ1-42干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥上清液對神經(jīng)元的作用比較:干

22、預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性上清液培養(yǎng)神經(jīng)元后，ELLSA檢測各組上清液中LDH的濃度，Aβ1-42+CD40L組與Aβ1-42組單獨干預(yù)組相比更能刺激神經(jīng)元LDH的釋放，加入抗CD40抗體組較Aβ1-42+CD40L組LDH釋放明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。炎癥上清液培養(yǎng)神經(jīng)元，與用Aβ1-42等直接培養(yǎng)神經(jīng)元比較，LDH釋放明顯增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 [結(jié)論]:
　　 1.Aβ1-42單體

23、、寡聚體及纖維體均可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)（包括固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答），其中，寡聚體的致炎癥效應(yīng)最強(qiáng)。
　　 2.Aβ1-42單體、寡聚體及纖維體均可誘導(dǎo)神經(jīng)元的損傷，但致炎后對神經(jīng)元的損傷更明顯。
　　 3.CD40L可以增強(qiáng)Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向抗原提呈功能轉(zhuǎn)化，加重神經(jīng)元的損傷?？笴D40抗體可以有效阻斷上述炎癥反應(yīng)。說明CD40L與Aβ1-42寡聚