可溶性CD40L誘導(dǎo)人突狀細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤。卵巢癌患者微環(huán)境中存在的大量免疫抑制分子抑制了樹(shù)突狀細(xì)胞( dendritic cell，DC)的功能，使機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)法識(shí)別，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。目前研究表明，以DC為基礎(chǔ)的免疫基因治療是通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能發(fā)揮抗腫瘤作用，這使其成為一種新型的腫瘤生物治療方法，越來(lái)越受到人們的重視。CD40L與DC表面CD40相互作用在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用?？扇苄訡D40配體(so

2、luble CD40 ligand，sCD40L)是由膜型CD40L水解形成，保留了CD40L的生物學(xué)特性。本課題旨在研究卵巢癌患者微環(huán)境中免疫抑制分子的表達(dá)水平及sCD40L聯(lián)合多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)DC后其生物學(xué)活性和功能的改變，初步探討DC刺激T細(xì)胞后生成的CTL對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖抑制及其作用機(jī)制，為sCD40L應(yīng)用于臨床免疫治療提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用半定量RT-PCR法檢測(cè)卵巢癌患者外周血

3、中免疫抑制分子IL-10和TGF-β mRNA的表達(dá)水平。
　　 2.sCD40L刺激臍血來(lái)源DC后，DC表型和分泌細(xì)胞因子的情況應(yīng)用倒置顯微鏡觀察DC形態(tài)學(xué)變化；分別用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)sCD40L作用前后DC表面CD80、CD86的表達(dá)；用半定量RT-PCR法檢測(cè)sCD40L作用前后DC分泌的細(xì)胞因子IL-23、IL-27、IL-10、TGF-β，Th0向Th1方向分化途徑中轉(zhuǎn)錄因子STAT4、T-bet及趨化

4、因子受體CCR7 mRNA的表達(dá)；用ELISA法檢測(cè)DC培養(yǎng)上清中TNF-a和IL-23的含量。
　　 3.sCD40L刺激DC前后對(duì)T細(xì)胞增殖能力和殺傷活性影響的測(cè)定用MTT法檢測(cè)sCD40L作用前后DC刺激T淋巴細(xì)胞的增殖能力；用半定量RT-PCR法檢測(cè)sCD40L作用前后DC與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后IFN-γ分泌水平；用MTT法檢測(cè)sCD40L作用前后經(jīng)凍融抗原致敏的DC刺激生成的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞( CTL)對(duì)人卵巢癌細(xì)胞S

5、KOV3體外增殖作用的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.卵巢癌患者外周血中免疫抑制分子IL-10和TGF-β mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組婦科良性腫瘤患者中的表達(dá)相比顯著升高(P＜0.05)。
　　 2.鏡下觀察，GM-CSF+IL-4+SCF+Flt-31+TNF-a組和GM-CSF+IL-4+SCF+Flt-31+sCD40L組誘導(dǎo)的成熟DC數(shù)量較GM-CSF+IL-4組和GM-CSF+IL-4+TNF-a組明顯增

6、多，并且細(xì)胞體積大，細(xì)胞表面毛刺狀突起較明顯；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)sCD40L作用后DC表面CD80、CD86分子表達(dá)水平，與未經(jīng)sCD40L作用組DC相比明顯增加，差異有顯著性(P＜0.05)；激光共聚焦顯微鏡下可觀察到sCD40L作用后DC表面CD80、CD86分子熒光強(qiáng)度表達(dá)升高（P＜0.05）；半定量RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)sCD40L刺激成熟的DC分泌的細(xì)胞因子IL-23、IL-27、STAT4、T-bet及CCR7mRN

7、A表達(dá)水平顯著增加，與未經(jīng)sCD40L作用組DC相比差異有顯著性(P＜0.05)；sCD40L誘導(dǎo)的成熟DC培養(yǎng)上清中TNF-a和IL-23的含量高于未經(jīng)sCD40L作用組(P＜0.05)；而DC分泌的免疫抑制因子IL-10和TGF-β mRNA表達(dá)水平則明顯降低(P＜0.05)。
　　 3.sCD40L誘導(dǎo)的DC與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后能分泌高水平的細(xì)胞因子IFN-γ; DC與T細(xì)胞按1：10比例混合培養(yǎng)時(shí)，刺激指數(shù)最大，DC刺激

8、T淋巴細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，與其他組相比有顯著性差異（P＜0.05）：經(jīng)sCD40L作用后的抗原致敏組DC刺激生成的CTL對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3有明顯的殺傷作用，并且在不同效靶比10:1、20:1、40:1作用時(shí)，CTL對(duì)SKOV3細(xì)胞的殺傷率隨效靶比的增加而增強(qiáng)，與未經(jīng)sCD40L作用的抗原致敏組和單獨(dú)T細(xì)胞組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.卵巢癌患者微環(huán)境中存在著免疫抑制因子，抑制了患者

9、免疫功能。
　　 2.sCD40L是有效促進(jìn)DC成熟的細(xì)胞因子之一，上調(diào)了DC表面CD80、CD86分子的表達(dá)；與細(xì)胞因子SCF、Flt-31聯(lián)合應(yīng)用后能促使細(xì)胞體積增大，胞體表面突起增多。
　　 3.sCD40L能提高抗原致敏的DC激發(fā)T細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力，其作用機(jī)制可能與sCD40L與DC表面CD40相互結(jié)合，促進(jìn)DC高分泌Th1型細(xì)胞因子IL-23、IL-27、TNF-α，抑制免疫抑制分子IL-10