雷公藤內(nèi)酯醇對耐順鉑人卵巢癌細(xì)胞體外活性影響及機(jī)制的探討.pdf

1、目的:
　　 進(jìn)一步研究雷公藤內(nèi)酯醇(TP)對耐順鉑人卵巢癌細(xì)胞株(COC1/DDP)的體外活性的影響,初步探討TP對COC1/DDP體外活性影響的機(jī)制及COC1/DDP細(xì)胞株的耐藥機(jī)制,為TP成為治療晚期或耐順鉑卵巢癌的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、COC1/DDP細(xì)胞傳代培養(yǎng):COC1/DDP細(xì)胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),將細(xì)胞密度調(diào)整至5×105/ml,置培養(yǎng)瓶中,在3

2、7℃、5％CO2、飽和濕度條件下于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞至對數(shù)生長期,吹打制成單細(xì)胞懸液,1000r/min,離心10min,棄上清液,更換培養(yǎng)基,按每瓶以5×105/ml密度補(bǔ)充液體容量至7ml接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)。
　　 2、MTT法檢測順鉑(DDP)對COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響:研究分實(shí)驗(yàn)組7個(gè):分別含(0.625、1.25、2.5、5、10、20、40)μg/ml DDP,并設(shè)空白對照組1個(gè)(只含COC1/DDP細(xì)胞完全

3、培養(yǎng)),其分別作用COC1/DDP細(xì)胞24h、48h、72h之后用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測每孔光吸收值(OD值)。結(jié)果可反映DDP對COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響,同時(shí)計(jì)算DDP對細(xì)胞的抑制率及IC50值。
　　 3、MTT法檢測TP對COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響:研究分實(shí)驗(yàn)組8個(gè)(陰性對照組、順鉑組、低濃度TP組、低濃度TP+順鉑組、中濃度TP組、中濃度TP+順鉑組、高濃度TP組、高濃度TP+順鉑組)及空白對照組1

4、個(gè),其分別作用于COC1/DDP細(xì)胞24h、48h、72h之后用MTT比色法檢測每孔OD值,同時(shí)計(jì)算TP對COC1/DDP細(xì)胞的抑制率。
　　 4、光鏡和電鏡觀察TP對COC1/DDP細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響:通過倒置光學(xué)顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察空白對照組和中濃度TP組(10ng/ml)分別作用COC1/DDP細(xì)胞24h后COC1/DDP細(xì)胞的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 5、流式細(xì)胞術(shù)檢測TP對COC1/DDP細(xì)胞凋

5、亡率和細(xì)胞周期的影響:取對數(shù)生長期COC1/DDP細(xì)胞細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測空白對照組、低濃度TP組(3ng/ml)、中濃度TP組(10ng/ml)和高濃度TP組(50ng/ml)各作用24h后細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的變化。
　　 6、DNA電泳分析TP對COC1/DDP細(xì)胞DNA的影響:研究分空白對照組和中濃度TP(10 ng/ml)組,作用COC1/DDP細(xì)胞24h后,分別提取兩組細(xì)胞中DNA,通過1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析兩

6、組細(xì)胞DNA變化情況。
　　 7、免疫組化Elivision TMplus法檢測Caspase-7蛋白在TP作用后COC1/DDP細(xì)胞的表達(dá)情況:設(shè)空白對照組和中濃度TP組(10ng/ml),分別作用COC1/DDP細(xì)胞24h后,離心固定兩組細(xì)胞,并按常規(guī)方法制備石蠟塊,用免疫組化ElivisionTMplus法檢測兩組細(xì)胞中Caspase-7蛋白表達(dá)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、COC1/DDP細(xì)胞生長曲線的

7、確定
　　 通過觀察COC1/DDP細(xì)胞的生長曲線,可以得知培養(yǎng)3-4天為細(xì)胞的對數(shù)生長期,以此確定取培養(yǎng)3-4天的細(xì)胞為研究用靶細(xì)胞。
　　 2、不同濃度DDP對COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響:
　　 DDP對COC1/DDP細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間-劑量依賴性。其藥物作用24h后的IC50為5.567μg/ml,作用48h后的IC50為2.866μg/ml,作用72h后的IC50為1.161μg/ml。COC1/

8、DDP細(xì)胞完全培養(yǎng)基中0.5μg/ml的DDP對COC1/DDP細(xì)胞的影響忽略不計(jì)。
　　 3、TP對COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響:
　　 TP對COC1/DDP細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間-劑量關(guān)系,不同濃度TP與2.5μg/mlDDP聯(lián)合作用于COC1/DDP呈現(xiàn)協(xié)同抑制作用(P<0.05)。
　　 4、TP對COC1/DDP細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響:
　　 4.1光學(xué)顯微鏡下觀察:空白對照組的細(xì)胞增殖良好,細(xì)胞

9、透光度強(qiáng),細(xì)胞形態(tài)呈圓形或不規(guī)則。TP組細(xì)胞密度較空白組減少,剩余細(xì)胞胞體變小,細(xì)胞變扁平,細(xì)胞形態(tài)多樣化,胞漿內(nèi)顆粒增多,培養(yǎng)液背景中可見細(xì)胞碎片。HE染色可見COC1/DDP細(xì)胞異型性,核漿比增高,巨核或多核等改變。
　　 4.2電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變:空白對照組細(xì)胞呈橢圓形,細(xì)胞核為卵圓形,染色質(zhì)豐富,細(xì)胞形態(tài)正常。TP組可見細(xì)胞顯凋亡改變,表現(xiàn)為:細(xì)胞膜表面微絨毛消失,細(xì)胞膜皺縮,胞漿濃縮并出現(xiàn)大小不等的空泡,細(xì)胞核

10、染色質(zhì)固縮、呈新月狀凝聚在核膜周邊,有凋亡小體形成。
　　 5、TP作用于COC1/DDP細(xì)胞后細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率的改變:
　　 不同濃度TP作用于COC1/DDP細(xì)胞24h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況,低、中、高濃度TP組均可見細(xì)胞凋亡圖像,凋亡率分別為:(2.69±0.23)％、(5.30±0.18)％、(16.67±0.22)％,S期細(xì)胞分別為:(48.86±0.61)％、(45.96±0.42)％、(38.7

11、2±1.11)％,G1期細(xì)胞分別為:(35.48±0.44)％、(45.38±0.35)％、(55.34±0.67)％,G2期細(xì)胞分別為:(15.67±0.71)％、(8.66±0.28)％、(5.94±0.90)％。結(jié)果提示,TP可促進(jìn)COC1/DDP細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞停滯在G1期,隨著TP濃度增加,細(xì)胞凋亡率增加,呈量效依賴關(guān)系(P<0.05)。
　　 6、TP對COC1/DDP細(xì)胞DNA的影響:
　　 TP作用于CO

12、C1/DDP細(xì)胞24h后,通過瓊脂糖凝膠DNA電泳分析可見細(xì)胞凋亡特征性改變的DNA圖譜“梯狀”條帶,而空白對照組細(xì)胞未見上述表現(xiàn)。
　　 7、免疫組化檢測TP作用COC1/DDP細(xì)胞24h后Caspase-7蛋白表達(dá):可見細(xì)胞漿染至棕黃色,Caspase-7蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)。而空白對照組部分細(xì)胞漿染呈淡黃色,Caspase-7蛋白弱陽性表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1、DDP對體外培養(yǎng)的COC1/DDP細(xì)胞有明顯

13、的抑制作用,且與時(shí)間及藥物濃度呈依賴性。完全培養(yǎng)基中含濃度為0.5μg/mlDDP對COC1/DDP細(xì)胞無抑制作用。
　　 2、TP對COC1/DDP有抑制作用,呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。
　　 3、不同濃度TP聯(lián)合2.5μg/ml的低劑量DDP對COC1/DDP細(xì)胞有協(xié)同抑制作用。
　　 4、TP可促進(jìn)COC1/DDP細(xì)胞凋亡,增加細(xì)胞凋亡率,其凋亡率的增加與TP濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。TP誘導(dǎo)COC1/DDP細(xì)胞凋