雷公藤內(nèi)酯醇對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響.pdf

1、一、研究背景與目的 冠狀動脈支架術(shù)后發(fā)生支架內(nèi)(in-stent)或(和)支架兩端(in-segment)的再狹窄，與炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)膜平滑肌增生和細(xì)胞外基質(zhì)合成等有關(guān)。近幾年來，隨著藥物洗脫支架的應(yīng)用，冠狀動脈介入治療后再狹窄率顯著降低。藥物洗脫支架抑制平滑肌細(xì)胞增殖，對預(yù)防血管幾何形態(tài)的重構(gòu)和內(nèi)膜增生均產(chǎn)生作用。然而即使是藥物洗脫支架的應(yīng)用，仍有3-10％左右的再狹窄發(fā)生，因此，人們探索冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄發(fā)生的機(jī)制仍不斷

2、深入。研究發(fā)現(xiàn)支架術(shù)后再狹窄系由于對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、血管內(nèi)膜的撕裂，至血管基底膜暴露，釋放多種細(xì)胞因子和生長因子，介導(dǎo)中層平滑肌細(xì)胞的內(nèi)膜下遷移、增殖，最終至血管狹窄。最新研究發(fā)現(xiàn)涂層藥物抗平滑肌增殖治療同時也可引起內(nèi)皮屏障功能損傷，間接促使再狹窄發(fā)生。作為內(nèi)皮細(xì)胞前體的內(nèi)皮祖細(xì)胞在內(nèi)皮損傷后的修復(fù)和成體血管新生中起重要作用。雷公騰內(nèi)酯醇是從衛(wèi)予科雷公藤屬植物雷公藤中提取的二萜內(nèi)酯化合物，具有抗增殖、抗炎和免疫抑制等作用。實驗發(fā)現(xiàn)雷公騰

3、內(nèi)酯醇可通過抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖來預(yù)防再狹窄。本研究采用體外培養(yǎng)人外周血EPC，觀察不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇對冠心病和非冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響，旨在探討冠狀動脈介入治療后再狹窄的可能機(jī)制，進(jìn)一步明確雷公藤內(nèi)酯醇對血管內(nèi)皮化的影響。 二、研究對象與方法 1、研究對象：2005年4月至2005年5月在浙江大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院的病人，均行冠狀動脈造影，共12例，其中，男6例，女6例，年齡56-77歲，中位數(shù)年

4、齡65歲。冠心病患者的診斷參照世界衛(wèi)生組織1979年診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除有外傷、潰瘍、視網(wǎng)膜病、炎癥、腫瘤、近期外科手術(shù)、近3個月發(fā)生急性心肌梗死的患者。 2、研究方法：密度剃度離心法獲取人外周血單個核細(xì)胞，接種至人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7天后收集貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)CD31、CD34、vwf相關(guān)抗原鑒定。實驗加入不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇(2.5ng/ml，5.0ng/ml，10.0ng/ml，20.0ng/ml)干預(yù)24小時

5、，采用MTT比色法、改良的Boyden小室和黏附能力測定實驗，分別觀察EPC的增殖、遷移和黏附能力。 3、統(tǒng)計方法：采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。計量資料以x±s表示，采用單因變量多因素方差分析(UnivariateAnalysisofVariance)，分析雷公藤內(nèi)酯醇濃度、冠狀動脈造影結(jié)果及Framingham評分對EPC各項功能的影響；雷公藤內(nèi)酯醇不同濃度組間資料比較采用LSD方法；在同一雷公藤內(nèi)酯醇濃度下，冠心病陰性和陽

6、性組間比較采用t檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 三、結(jié)果 1、EPC的分離與鑒定 剛分離獲得的單個核細(xì)胞是圓形的，體積較小，懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)24h后，除去較快貼壁的血液中脫落的成熟內(nèi)皮細(xì)胞，重新接種懸浮細(xì)胞。第4～7d，貼壁細(xì)胞體積逐漸增大，大部分細(xì)胞由圓形逐漸伸展變成長梭形，小部分細(xì)胞呈鵝卵石樣形態(tài)。分別用兔抗人vwf相關(guān)抗原多克隆抗體、鼠抗人CD31、CD34單克隆抗體檢測第7d貼壁細(xì)胞表面相關(guān)抗原的

7、表達(dá)，結(jié)果均呈陽性。 2、單因變量多因素方差分析結(jié)果 冠心病陽性和陰性組入選成員的臨床資料，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在用Framingham評分控制危險因素的情況下，提示在雷公藤不同濃度組間總體上存在差異，同時，雷公藤濃度相同的情況下，冠心病陽性與陰性組之間存在差異。 3、雷公藤內(nèi)酯醇對外周血EPC生物學(xué)功能的影響 各雷公藤濃度組間均存在顯著性差異。雷公藤內(nèi)酯醇能影響EPC的各項生物學(xué)功能，使EPC的粘附

8、能力、遷移功能、增殖能力顯著被抑制，這些改變均呈明顯的濃度依賴性，在20ng/ml濃度組EPC各項功能達(dá)最大抑制。 4、冠心病與非冠心病組間的比較 在對照組及2.5ng/ml雷公藤內(nèi)酯醇濃度下，冠心病患者EPC細(xì)胞的粘附、遷移和增殖功能均明顯低于非冠心病組；在5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml雷公藤內(nèi)酯醇濃度下，冠心病陽性和陰性患者EPC功能差異逐漸縮小。 四、本實驗研究的結(jié)論： 1、冠心病患者