CD40L轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞致敏DC抗腫瘤免疫的研究.pdf

1、鑒于化療、放療對(duì)腫瘤治療的局限，通過調(diào)動(dòng)腫瘤患者自身潛能，抵抗腫瘤的免疫性治療顯得更為理性。它不僅對(duì)前者抑癌作用是有效補(bǔ)充，而且對(duì)患者機(jī)體機(jī)能狀態(tài)是一種有力的調(diào)整與支持，因此，一直被期待著。近年來，隨著免疫學(xué)研究的發(fā)展，特別對(duì)樹突狀細(xì)胞(DC)及一些細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)中作用認(rèn)識(shí)的深入，使腫瘤的免疫治療有了新的思路抗腫瘤疫苗是腫瘤腫免疫治療中有良好前景的方法之一，其中DC疫苗，受到更多關(guān)注。如何使DC呈遞的腫瘤抗原更特異，對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的激

2、發(fā)更有力，是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。CD40與配體CD40LCDl54)在免疫系統(tǒng)存在于不同細(xì)胞表面，二者相互作用，對(duì)于調(diào)節(jié)體液與細(xì)胞免疫反應(yīng)具有樞紐作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，CD40信號(hào)的激活可為惡性腫瘤治療開拓新的途徑，一定狀態(tài)下，CD40L與腫瘤細(xì)胞表面CD40結(jié)合，可直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，增加抗腫瘤制劑的敏感性。更重要的是，可以增強(qiáng)患者抵抗腫瘤的免疫能力。本研究利用DC與CD40L在免疫反應(yīng)中各自的特殊作用，構(gòu)建一種經(jīng)CD40L與同源腫瘤成份

3、共同刺激致敏的DC細(xì)胞疫苗。探索其激發(fā)抗腫瘤免疫的效能及臨床應(yīng)用的可行性。 一、材料與方法： 1．構(gòu)建h-CD40L表達(dá)體系 (1)運(yùn)用細(xì)胞分離與培養(yǎng)技術(shù)，由人血中分離T淋巴細(xì)胞，激活后，提取T細(xì)胞總RNA。 (2)以RT-PCR方法，逆轉(zhuǎn)、擴(kuò)增CD40L基因片段。 (3)純化CD40L基因片段與pMD-18-T載體連接，構(gòu)成CD40L重組克隆載體，轉(zhuǎn)化于DH5a感受態(tài)菌，經(jīng)氨芐、藍(lán)、白斑篩選，菌

4、液質(zhì)粒的PCR及DNA測(cè)序，鑒定重組克隆載體。 (4)用質(zhì)粒提取試劑盒，由轉(zhuǎn)化菌中，分別提取重組克隆載體pMD-18-T-CD40L與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，經(jīng)酶切、純化、連接，得重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CD40L，轉(zhuǎn)化于TOP10感受態(tài)菌。再經(jīng)氨芐篩選、菌液質(zhì)粒的PCR、Nhe Ⅰ與Knp Ⅰ雙酶切及DNA測(cè)序?qū)χ亟M真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CD40L鑒定。 2．CD40L表達(dá)載體的腫瘤

5、細(xì)胞轉(zhuǎn)染 (1)解凍、復(fù)蘇并培養(yǎng)H446細(xì)胞株，接種后，以脂質(zhì)體法對(duì)該細(xì)胞行peDNA3.1-CD40L轉(zhuǎn)染。 (2) 以RT-PCR與流式細(xì)胞技術(shù)，對(duì)H446轉(zhuǎn)染細(xì)胞的CD40LmRNA轉(zhuǎn)錄及PE標(biāo)記抗CD40L染色后CD40L胞膜表達(dá)率檢測(cè)。 (3)以不同構(gòu)型pcDNA3.1-CD40L重組質(zhì)粒，分別對(duì)SK-hep Ⅰ、H446與H460三種細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分析CD40L表達(dá)狀況。 (4)運(yùn)用細(xì)胞原代

6、培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)手術(shù)切得肺癌組織，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，隨即行pcDNA3.1-CD40L轉(zhuǎn)染，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD40L表達(dá)率。 3．轉(zhuǎn)染后，表達(dá)CD40L的肺癌細(xì)胞沖擊致敏DC的體外免疫功能的測(cè)試： (1)以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行DC細(xì)胞誘導(dǎo)及同源T細(xì)胞培養(yǎng)。 (2)1％福爾馬林處理未轉(zhuǎn)染的、空載轉(zhuǎn)染的以及CD40L轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418篩選的H460細(xì)胞，制備特異致敏物，對(duì)誘導(dǎo)7天的DC沖擊致敏。 (3)以流式細(xì)胞技術(shù)

7、，對(duì)未轉(zhuǎn)染與重組轉(zhuǎn)染組致敏DC表面分子CD83、CD86及HLA-DR(MHC-Ⅱ)的表達(dá)檢測(cè)并比較。 (4)以ELIAS法，對(duì)未轉(zhuǎn)染、空載與重組轉(zhuǎn)染各組致敏DC的IL-12分泌量檢測(cè)并比較。 (5)致敏DC經(jīng)絲裂霉素增殖抑制處理后與同源T細(xì)胞共同培養(yǎng)5天，以MTT法對(duì)未轉(zhuǎn)染、空載與重組轉(zhuǎn)染各組T細(xì)胞增殖進(jìn)行測(cè)試并比較。 (6)致敏DC經(jīng)絲裂霉素增殖抑制處理后與一定比例同源T細(xì)胞及親代H640細(xì)胞共同培養(yǎng)72小時(shí)

8、，MTT法對(duì)未轉(zhuǎn)染、空載與重組轉(zhuǎn)染組H460細(xì)胞的增殖抑制測(cè)試并比較。 結(jié)果： 1．由人激活T細(xì)胞所提總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增得到CD40L目的基因。 2．重組的pMD-18-T-CD40L篩選后進(jìn)行DNA測(cè)序，插入片段與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫收錄編號(hào)為BC071754 CD40L序列中40至915堿基序列完全相符。 3．pMD-18-T-CD40L與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)分別酶切、重組后，所

9、獲重組表達(dá)載體pcDNA3.1-CD40L，經(jīng)酶切、PCR及DNA測(cè)序鑒定，確認(rèn)該載體中插入的DNA序列，與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫所收錄編號(hào)為BC071754 CD40L序列中，40至915堿基序列完全相符，并且方向一致。 4．pcDNA3.1-CD40L轉(zhuǎn)染的H446，經(jīng)PCR檢測(cè)，存在CD40LrnRNA轉(zhuǎn)錄。PE標(biāo)記抗CD40L染色后流式細(xì)胞儀測(cè)試，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有CD40L表達(dá)。提示：該重組載體能在腫瘤細(xì)胞中正常地執(zhí)行CD40L

10、轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白質(zhì)合成的功能。 5．不同構(gòu)型pcDNA3.1-CD40L表達(dá)體系轉(zhuǎn)染于不同類型的細(xì)胞，其表達(dá)有差異，H446以環(huán)型表達(dá)偏高，而SK-hep Ⅰ線型表達(dá)較高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6．pcDNA3.1-CD40L分別轉(zhuǎn)染SK-hep Ⅰ、H446與H460三種細(xì)胞株，CD40L表達(dá)率明顯不同，其順序H446>SK-hep Ⅰ>H460。 7．pcDNA3.1-CD40L轉(zhuǎn)染肺癌原代培養(yǎng)細(xì)胞，空載與轉(zhuǎn)染組中

11、均有CD40L表達(dá)，重組轉(zhuǎn)染組明顯高于空載組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 8．重組體轉(zhuǎn)染H460后，經(jīng)G418篩選，CD40L表達(dá)可達(dá)80％以上。 9．重組轉(zhuǎn)染后，表達(dá)CD40L的H460細(xì)胞經(jīng)處理致敏DC，DC表面分子CD83、MHC-Ⅱ表達(dá)高于空載組并具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD86雖高于空載組，但尚不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 10．上述致敏物沖擊DC細(xì)胞后其LI-12的分泌量、對(duì)同源T細(xì)胞的增殖作用，CD40L重組轉(zhuǎn)染組均高于未轉(zhuǎn)

12、染組與空載組并具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且對(duì)親代H460的增殖有抑制作用。 結(jié)論： 1．人CD40L表達(dá)載體的成功構(gòu)建，為以CD40L為組件抗腫瘤疫苗的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。 2．pcDNA3.1(+)-CD40L表達(dá)載體，以脂質(zhì)法進(jìn)行腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，載體的構(gòu)型不同、轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不同，CD40L的表達(dá)率也明顯不同，除了脂質(zhì)體與重組載體配比，它與載體的構(gòu)型及細(xì)胞生理狀態(tài)密切關(guān)系。 3．人CD40L在原代肺癌細(xì)胞中能夠進(jìn)行