CD40L轉(zhuǎn)染肺癌細胞致敏DC抗腫瘤免疫的研究.pdf

1、鑒于化療、放療對腫瘤治療的局限，通過調(diào)動腫瘤患者自身潛能，抵抗腫瘤的免疫性治療顯得更為理性。它不僅對前者抑癌作用是有效補充，而且對患者機體機能狀態(tài)是一種有力的調(diào)整與支持，因此，一直被期待著。近年來，隨著免疫學研究的發(fā)展，特別對樹突狀細胞(DC)及一些細胞因子在免疫反應中作用認識的深入，使腫瘤的免疫治療有了新的思路抗腫瘤疫苗是腫瘤腫免疫治療中有良好前景的方法之一，其中DC疫苗，受到更多關(guān)注。如何使DC呈遞的腫瘤抗原更特異，對T效應細胞的激

2、發(fā)更有力，是當今研究的熱點。CD40與配體CD40LCDl54)在免疫系統(tǒng)存在于不同細胞表面，二者相互作用，對于調(diào)節(jié)體液與細胞免疫反應具有樞紐作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，CD40信號的激活可為惡性腫瘤治療開拓新的途徑，一定狀態(tài)下，CD40L與腫瘤細胞表面CD40結(jié)合，可直接抑制腫瘤細胞增殖，增加抗腫瘤制劑的敏感性。更重要的是，可以增強患者抵抗腫瘤的免疫能力。本研究利用DC與CD40L在免疫反應中各自的特殊作用，構(gòu)建一種經(jīng)CD40L與同源腫瘤成份

3、共同刺激致敏的DC細胞疫苗。探索其激發(fā)抗腫瘤免疫的效能及臨床應用的可行性。 一、材料與方法： 1．構(gòu)建h-CD40L表達體系 (1)運用細胞分離與培養(yǎng)技術(shù)，由人血中分離T淋巴細胞，激活后，提取T細胞總RNA。 (2)以RT-PCR方法，逆轉(zhuǎn)、擴增CD40L基因片段。 (3)純化CD40L基因片段與pMD-18-T載體連接，構(gòu)成CD40L重組克隆載體，轉(zhuǎn)化于DH5a感受態(tài)菌，經(jīng)氨芐、藍、白斑篩選，菌

4、液質(zhì)粒的PCR及DNA測序，鑒定重組克隆載體。 (4)用質(zhì)粒提取試劑盒，由轉(zhuǎn)化菌中，分別提取重組克隆載體pMD-18-T-CD40L與真核表達載體pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，經(jīng)酶切、純化、連接，得重組真核表達載體pcDNA3.1-CD40L，轉(zhuǎn)化于TOP10感受態(tài)菌。再經(jīng)氨芐篩選、菌液質(zhì)粒的PCR、Nhe Ⅰ與Knp Ⅰ雙酶切及DNA測序?qū)χ亟M真核表達載體pcDNA3.1-CD40L鑒定。 2．CD40L表達載體的腫瘤

5、細胞轉(zhuǎn)染 (1)解凍、復蘇并培養(yǎng)H446細胞株，接種后，以脂質(zhì)體法對該細胞行peDNA3.1-CD40L轉(zhuǎn)染。 (2) 以RT-PCR與流式細胞技術(shù)，對H446轉(zhuǎn)染細胞的CD40LmRNA轉(zhuǎn)錄及PE標記抗CD40L染色后CD40L胞膜表達率檢測。 (3)以不同構(gòu)型pcDNA3.1-CD40L重組質(zhì)粒，分別對SK-hep Ⅰ、H446與H460三種細胞株進行轉(zhuǎn)染，分析CD40L表達狀況。 (4)運用細胞原代

6、培養(yǎng)技術(shù)，對手術(shù)切得肺癌組織，進行原代細胞培養(yǎng)，隨即行pcDNA3.1-CD40L轉(zhuǎn)染，流式細胞技術(shù)檢測CD40L表達率。 3．轉(zhuǎn)染后，表達CD40L的肺癌細胞沖擊致敏DC的體外免疫功能的測試： (1)以細胞培養(yǎng)技術(shù)進行DC細胞誘導及同源T細胞培養(yǎng)。 (2)1％福爾馬林處理未轉(zhuǎn)染的、空載轉(zhuǎn)染的以及CD40L轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418篩選的H460細胞，制備特異致敏物，對誘導7天的DC沖擊致敏。 (3)以流式細胞技術(shù)

7、，對未轉(zhuǎn)染與重組轉(zhuǎn)染組致敏DC表面分子CD83、CD86及HLA-DR(MHC-Ⅱ)的表達檢測并比較。 (4)以ELIAS法，對未轉(zhuǎn)染、空載與重組轉(zhuǎn)染各組致敏DC的IL-12分泌量檢測并比較。 (5)致敏DC經(jīng)絲裂霉素增殖抑制處理后與同源T細胞共同培養(yǎng)5天，以MTT法對未轉(zhuǎn)染、空載與重組轉(zhuǎn)染各組T細胞增殖進行測試并比較。 (6)致敏DC經(jīng)絲裂霉素增殖抑制處理后與一定比例同源T細胞及親代H640細胞共同培養(yǎng)72小時

8、，MTT法對未轉(zhuǎn)染、空載與重組轉(zhuǎn)染組H460細胞的增殖抑制測試并比較。 結(jié)果： 1．由人激活T細胞所提總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增得到CD40L目的基因。 2．重組的pMD-18-T-CD40L篩選后進行DNA測序，插入片段與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫收錄編號為BC071754 CD40L序列中40至915堿基序列完全相符。 3．pMD-18-T-CD40L與真核表達載體pcDNA3.1(+)分別酶切、重組后，所

9、獲重組表達載體pcDNA3.1-CD40L，經(jīng)酶切、PCR及DNA測序鑒定，確認該載體中插入的DNA序列，與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫所收錄編號為BC071754 CD40L序列中，40至915堿基序列完全相符，并且方向一致。 4．pcDNA3.1-CD40L轉(zhuǎn)染的H446，經(jīng)PCR檢測，存在CD40LrnRNA轉(zhuǎn)錄。PE標記抗CD40L染色后流式細胞儀測試，轉(zhuǎn)染細胞中有CD40L表達。提示：該重組載體能在腫瘤細胞中正常地執(zhí)行CD40L

10、轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白質(zhì)合成的功能。 5．不同構(gòu)型pcDNA3.1-CD40L表達體系轉(zhuǎn)染于不同類型的細胞，其表達有差異，H446以環(huán)型表達偏高，而SK-hep Ⅰ線型表達較高且有統(tǒng)計學意義。 6．pcDNA3.1-CD40L分別轉(zhuǎn)染SK-hep Ⅰ、H446與H460三種細胞株，CD40L表達率明顯不同，其順序H446>SK-hep Ⅰ>H460。 7．pcDNA3.1-CD40L轉(zhuǎn)染肺癌原代培養(yǎng)細胞，空載與轉(zhuǎn)染組中

11、均有CD40L表達，重組轉(zhuǎn)染組明顯高于空載組，兩組差異有統(tǒng)計學意義。 8．重組體轉(zhuǎn)染H460后，經(jīng)G418篩選，CD40L表達可達80％以上。 9．重組轉(zhuǎn)染后，表達CD40L的H460細胞經(jīng)處理致敏DC，DC表面分子CD83、MHC-Ⅱ表達高于空載組并具統(tǒng)計學意義。CD86雖高于空載組，但尚不具統(tǒng)計學意義。 10．上述致敏物沖擊DC細胞后其LI-12的分泌量、對同源T細胞的增殖作用，CD40L重組轉(zhuǎn)染組均高于未轉(zhuǎn)

12、染組與空載組并具統(tǒng)計學意義。并且對親代H460的增殖有抑制作用。 結(jié)論： 1．人CD40L表達載體的成功構(gòu)建，為以CD40L為組件抗腫瘤疫苗的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。 2．pcDNA3.1(+)-CD40L表達載體，以脂質(zhì)法進行腫瘤細胞轉(zhuǎn)染時，載體的構(gòu)型不同、轉(zhuǎn)染的細胞不同，CD40L的表達率也明顯不同，除了脂質(zhì)體與重組載體配比，它與載體的構(gòu)型及細胞生理狀態(tài)密切關(guān)系。 3．人CD40L在原代肺癌細胞中能夠進行