骨碎補對人牙髓細胞體外誘導的作用.pdf

1、目的：牙髓組織是由牙體硬組織包繞起來的特殊結(jié)締組織，是由細胞和細胞間質(zhì)組成，具有營養(yǎng)、代謝和修復等多種功能。當牙本質(zhì)受到外界刺激或受到損傷時，牙髓細胞中某些前體細胞可被激活，分化成為成牙本質(zhì)樣細胞，形成修復性牙本質(zhì)，最終礦化。如何增強牙髓細胞活性，提高細胞的分化潛能，是當前牙體牙髓病學領域研究的一個主要課題。人牙髓細胞體外原代培養(yǎng)體系是研究人牙髓細胞的主要體外模型，隨著體外組織培養(yǎng)技術(shù)及組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外學者相繼培養(yǎng)了人和多

2、種動物牙髓組織細胞，以從細胞分子水平研究牙髓細胞的生物學特性。本實驗利用組織塊培養(yǎng)方法，從原代培養(yǎng)人牙髓細胞入手，旨在建立研究人牙髓細胞各種功能的良好模型，獲得大量既較好的保存了源組織細胞特性，又避免受體內(nèi)多種因素干擾的可供實驗的種子細胞，為觀察藥物對人牙髓細胞體外的作用影響建立良好的技術(shù)平臺。 骨碎補為中國傳統(tǒng)骨傷科常用中藥，具有補腎、活血、止痛、續(xù)骨療傷之功效，其可促進體外成骨細胞增殖、分化、鈣化。本實驗首次利用骨碎補的獨特

3、的藥理作用，將其作用于體外培養(yǎng)的人牙髓細胞，觀察不同濃度骨碎補對人牙髓細胞體外誘導作用。通過檢測培養(yǎng)細胞堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)活性，總蛋白合成，以及利用免疫組化方法觀察細胞纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)合成、分泌情況，摸索骨碎補對人牙髓細胞體外誘導的藥物濃度效應及最佳作用濃度，為將來骨碎補可作為一種新型的誘導劑應用于人牙髓細胞組織工程領域，并作為一種理想的蓋髓劑應用于臨床提供一定的理論

4、基礎。 方法：采用組織塊法分離培養(yǎng)人牙髓細胞，制備骨碎補提取液作用于體外培養(yǎng)的牙髓細胞，測定培養(yǎng)細胞ALP活性，總蛋白含量以及FN合成、分泌情況，觀察骨碎補對該細胞體外誘導作用。 1人牙髓細胞的原代培養(yǎng)及傳代選取年輕健康的因正畸拔除的前磨牙或因阻生拔除的第三磨牙，在無菌條件下取出牙髓組織，采用組織塊法進行牙髓細胞原代培養(yǎng)。當細胞生長至鋪滿瓶底80％時進行傳代。經(jīng)傳代后獲得了大量可供實驗用種子細胞。 2骨碎補提取液

5、的制備將骨碎補加水煎煮，過濾，濃縮，醇沉，活性炭脫色，過濾除菌。提取液用含2％胎牛血清(Fetalbovineserum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)液稀釋成5個不同終濃度。調(diào)制pH至7.0～7.1，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?3實驗分組實驗組加入骨碎補提取液，對照組加入含2％FBS的DMEM。 4形態(tài)學觀察在倒置相差顯微鏡下觀察原代細胞游出情況及傳代后細胞生長狀態(tài)，并行吉姆薩染色，光學顯微鏡下觀察。 5ALP活性及細胞總蛋

6、白測定取第5代牙髓細胞以1×105/ml的細胞濃度接種24孔培養(yǎng)板，孵育24h，設5個濃度實驗組和1個對照組，每組3孔，繼續(xù)培養(yǎng)14d，棄孔內(nèi)液體，加入TritonX-100，4℃過夜后，進行如下的實驗：①取上述各孔液體及空白對照的蒸餾水一并轉(zhuǎn)入另一96孔板。按ALP試劑盒說明依次按比例加入緩沖液、基質(zhì)液，水浴，加入顯色劑后在酶聯(lián)儀上于410nm波長下測OD值，取每組3孔的平均值，間接反映細胞ALP活性。②取上述各孔液體，加考馬斯亮藍染

7、液，振蕩，在分光光度儀上于595nm波長下測OD值，取每組3孔的平均值，檢測細胞總蛋白合成情況。 6免疫組化染色取第5代牙髓細胞，以2×105/ml的濃度接種于放有1×1cm大小蓋玻片的12孔板中，孵育24h，設1個最好濃度骨碎補實驗組和1個對照組，每組3孔，繼續(xù)培養(yǎng)14d，甲醛固定后進行免疫組化染色，光學顯微鏡下觀察。 7統(tǒng)計學方法采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，檢測結(jié)果以均數(shù)±標準差(-x±S)表示，P＜0.05為差異

8、有統(tǒng)計學意義，應用單因素方差分析方法對ALP及總蛋白檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，得到骨碎補作用的最佳濃度。 結(jié)果： 1采用原代培養(yǎng)法成功培養(yǎng)出人牙髓細胞。倒置相差顯微鏡下觀察，3d～7d有細胞從組織塊周圍游出，放射狀排列。15d時組胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶底的80％。 2經(jīng)傳代消化后細胞回縮呈小球形，折光性好，4h左右開始伸展，24h后細胞大部分貼壁，伸展成均一的梭形。當培養(yǎng)時間延長至14d，細胞生長密集時可出現(xiàn)復層生長。

9、 3吉姆薩染色可見細胞胞核呈藍紫色，胞漿染成粉紅色，均勻，胞體豐滿伸展良好，核圓，核仁清晰。 4ALP檢測結(jié)果顯示實驗組ALP的OD值均高于對照組(P＜0.05)，且實驗組骨碎補濃度為100μg/ml時其ALP活性最佳。 5總蛋白測定結(jié)果顯示在骨碎補濃度為10μg/ml時其總蛋白含量與對照組之間差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，隨骨碎補濃度增加，實驗組細胞總蛋白含量高于對照組(P＜0.05)，尤以500μg/ml骨

10、碎補濃度組作用最佳。 6免疫組化染色：實驗組與對照組均有FN表達陽性的細胞，但實驗組與對照組比較FN呈強陽性表達。 結(jié)論： 1采用組織塊法可成功培養(yǎng)出人牙髓細胞，原代及傳代細胞呈均一的成纖維細胞樣，生長旺盛，分裂較快，出現(xiàn)復層生長，可作為實驗中種子細胞大量使用。 2中藥骨碎補可誘導體外人牙髓細胞ALP活性增強，促進細胞貨白質(zhì)的合成及FN的合成、分泌，對細胞向成牙本質(zhì)樣細胞分化有一定的定向誘導作用。骨碎補可