免疫細(xì)胞體外誘導(dǎo)及培養(yǎng)

1、過(guò)繼性T細(xì)胞治療是過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療研究的重點(diǎn)，但對(duì)MHCI類分子陰性的腫瘤細(xì)胞無(wú)效，而NK細(xì)胞(NaturalkillercellNK細(xì)胞)由于表達(dá)MHCI類分子的抑制性受體殺傷細(xì)胞抑制性受體(KillerinhibityreceptKIR)，可以殺滅MHCI類分子陰性的腫瘤，隨著對(duì)NK細(xì)胞研究的深入，目前NK細(xì)胞用于腫瘤免疫治療成為研究熱點(diǎn)。19世紀(jì)80年代興起的細(xì)胞過(guò)繼免疫治療帶給了腫瘤患者一個(gè)新的希望。自然殺傷(naturalk

2、illerNK)細(xì)胞作為機(jī)體抗腫瘤的第一道防線，再加上其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用是由其表面抑制性受體和活化性受體的共同信號(hào)決定，所以NK細(xì)胞成為近年細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的研究熱點(diǎn)。自然殺傷細(xì)胞表面標(biāo)志與分類自然殺傷細(xì)胞表面標(biāo)志與分類1依據(jù)依據(jù)表面標(biāo)志表面標(biāo)志分為分為CD56bright和CD56dim兩個(gè)亞群兩個(gè)亞群NK細(xì)胞表達(dá)眾多表細(xì)胞表達(dá)眾多表面分子，但只具有相對(duì)特異性。通常將面分子，但只具有相對(duì)特異性。通常將CD56CDl6CD3TCR―

3、BCR―的淋巴的淋巴樣細(xì)胞定為樣細(xì)胞定為NK細(xì)胞，并以細(xì)胞，并以CD56的表達(dá)密度不同，將的表達(dá)密度不同，將NK分為分為CD56bright和CD56dim兩群。兩群。CD56brightNK細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞高表達(dá)CD56、CD94／NKG2A和L選擇素選擇素(CD62L)；低表達(dá)；低表達(dá)CDl6和KIR；表達(dá)高親和力的；表達(dá)高親和力的IL2受體受體(1L2RapY)。而。而CD56dimNK細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞高表達(dá)CDl6、PEN5、KIR

4、和LFA―1；低表達(dá)；低表達(dá)CD56，CD94／NKG2A；僅表達(dá)不帶。鏈的中親和力的；僅表達(dá)不帶。鏈的中親和力的IL2受體受體(IL2Rβγ)。NK細(xì)胞亞群細(xì)胞亞群CD56bright和aD56dim的表型特點(diǎn)的表型特點(diǎn)2依據(jù)依據(jù)細(xì)胞因子分泌格局細(xì)胞因子分泌格局分為分為NKl和NK2兩個(gè)亞群兩個(gè)亞群NK細(xì)胞也存在著類似細(xì)胞也存在著類似Thl和Th2樣的亞群。分離外周樣的亞群。分離外周CDl6，或，或CD56細(xì)胞，用細(xì)胞，用ILl2和抗

5、和抗IL―4抗體抗體可以誘導(dǎo)出分泌可以誘導(dǎo)出分泌IFN―Y的Thl型NK亞群，用亞群，用IL4和抗體和抗體誘導(dǎo)出分泌誘導(dǎo)出分泌IL5、ILl3的Th2型NK細(xì)胞亞群，分別命名為細(xì)胞亞群，分別命名為NKl和NK2。也有人認(rèn)為。也有人認(rèn)為NK細(xì)胞發(fā)育經(jīng)歷細(xì)胞發(fā)育經(jīng)歷K2一NK0一NKl的過(guò)程。在這一過(guò)程中的過(guò)程。在這一過(guò)程中IL4促進(jìn)促進(jìn)NK2增殖；增殖；ILl2促使促使NK2向NKl轉(zhuǎn)變，并促進(jìn)轉(zhuǎn)變，并促進(jìn)NKl的或熟。的或熟。3依據(jù)依據(jù)

6、黏附功能黏附功能分為黏附分為黏附NK和非黏附和非黏附NK兩個(gè)亞群兩個(gè)亞群根據(jù)根據(jù)NK細(xì)胞在細(xì)胞在IL2的誘導(dǎo)下表現(xiàn)出的黏附能力，分為的誘導(dǎo)下表現(xiàn)出的黏附能力，分為黏附黏附NK(A―NK)和非黏附和非黏附NK(NA―NK)兩個(gè)亞群。個(gè)亞群。A―NK細(xì)胞的表型比較均一，主要為細(xì)胞的表型比較均一，主要為CD3―CD56dimCDl6十IL2R，不含，不含CD56bright細(xì)胞。細(xì)胞。NA―NK細(xì)胞是具有不同表型的異質(zhì)性群體，細(xì)胞是具有不同表

7、型的異質(zhì)性群體，各種表型如各種表型如CD56bright、CD56dim、CD56―、CDl6十、CDl6―均可存在。均可存在。方法：1.采取10例健康志愿者和山西省腫瘤醫(yī)院血液科10例AML患者外周血15ml運(yùn)用常規(guī)單個(gè)核細(xì)胞提取法提取單個(gè)核細(xì)胞，分別放于含有SCGM培濃度至5106ml，添加細(xì)胞因子(包括1000UmlrhIL2、10ngmlrhIL12、10ngmlrhIL15、10ngmlrhIL21)后培養(yǎng)于37℃5%CO2孵

8、箱中6天。根據(jù)不同培養(yǎng)基及是否添加rhIL18將實(shí)驗(yàn)組分為AIMVrhIL18組及SCGMrhIL18組rhIL18濃度為20ngml。每隔2~3天半量換液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2106ml并補(bǔ)充相應(yīng)細(xì)胞因子。收集培養(yǎng)到第3天(D3)及第6天(D6)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、NK純度及功能表型檢測(cè)。結(jié)果：SCGMrhIL18相比AIMV組能使NK細(xì)胞擴(kuò)增能力明顯增強(qiáng)培養(yǎng)到D6天NK細(xì)胞絕對(duì)值上調(diào)4~8倍NK純度提高10%~20%(P0.05)。培養(yǎng)到D

9、6天時(shí)SCGMrhIL18相比AIMV組能使NK細(xì)胞的穿孔素、顆粒酶的表達(dá)分別上調(diào)(194)%及(104)%(P0.05)遷移表型CD62L及成熟表型CD57的表達(dá)分別上調(diào)(124)%及(72)%(P0.05)。而且SCGMrhIL18能使NK細(xì)胞分泌更高水平IFNγ(P0.05)。另外NK細(xì)胞的功能表型及分泌IFNγ的能力隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)明顯遞增(D6D3D0)(P0.05)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證明SCGM培養(yǎng)基聯(lián)合IL121518是體外

10、培養(yǎng)制備NK細(xì)胞的更好策略能進(jìn)一步提高NK細(xì)胞的純度、絕對(duì)值、功能表型及分泌IFNγ的能力。本實(shí)驗(yàn)為臨床上同種異體NK細(xì)胞治療移植后復(fù)發(fā)AML提供了理論依據(jù)：有望進(jìn)一步提高GVL效應(yīng)并減少GVHD發(fā)生。惡性腫瘤所致的死亡率中，白血病在男性中居第六位，女性中居第八位，兒童及35歲以下成人中則居第一位。白血病的治療目前包括放、化療藥物降低瘤負(fù)荷獲得緩解；移植和免疫治療。CTL(CytotoxicTcellCTL)細(xì)胞目前在血液臨床方面主要應(yīng)

11、用于外周血干細(xì)胞移植和其他過(guò)繼免疫治療中。根據(jù)移植物的來(lái)源不同移植分為自體移植和同型異體移植。自體外周血干細(xì)胞移植(AutoHSCT)無(wú)GVHD，移植后生活質(zhì)量較高，但因無(wú)GVLE(graftversusgosteffect，GVLE)，易復(fù)發(fā)。自體外周血干細(xì)胞移植主要靠自身CTL細(xì)胞殺滅腫瘤細(xì)胞。如果在移植后輔助性輸注一定量的自身體外誘導(dǎo)的白血病抗原特異性的CTL細(xì)胞，復(fù)發(fā)問(wèn)題可能會(huì)在一定程度上得以解決。或自體移植的基礎(chǔ)上輸入一定量的

12、供者來(lái)源的白血病細(xì)胞特異性的CTL細(xì)胞，增加GVLE，在某種程度上可能會(huì)改變自體移植的效果。異基因造血干細(xì)胞移植(AllogeneicsterncelltransplantionAlloSCT)，由于存在GVLE，使得一些患者能夠得以長(zhǎng)期生存，然而伴隨而來(lái)的移植物抗宿主病(GraftversushostdiseaseGVHD)，嚴(yán)重感染，植入失敗，造血重建延遲等相關(guān)并發(fā)癥成為移植成功的巨大障礙。CTL細(xì)胞是GVHD及GVLE的效應(yīng)細(xì)胞，