激動星形膠質(zhì)細(xì)胞上Ⅱ、Ⅲ組mGluRs對中腦神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、激動星形膠質(zhì)細(xì)胞上Ⅱ、Ⅲ組mGluRs對中腦神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制研究帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)是一種錐體外系功能紊亂引起的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理學(xué)特征表現(xiàn)為黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性變性、缺失，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元投射減少，出現(xiàn)一系列臨床癥狀。目前臨床仍以替代治療為主，左旋多巴和D2受體激動劑能改善PD癥狀，但不能阻制疾病發(fā)展，這使人們對PD治療的認(rèn)識由

2、單純替代療法逐漸轉(zhuǎn)向保護(hù)中腦DA能神經(jīng)元。盡管PD的確切病因還不清楚，但大量研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和功能異常能促進(jìn)、加劇DA能神經(jīng)元的缺失，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能被認(rèn)為是保護(hù)DA能神經(jīng)元的重要策略。 星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞類型，不僅為神經(jīng)元提供營養(yǎng)和結(jié)構(gòu)支持，也和神經(jīng)元共同調(diào)控信號傳導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)與神經(jīng)元的通訊或?qū)υ?，促進(jìn)和引導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)生。更重要的是，星形膠質(zhì)細(xì)胞上的各種轉(zhuǎn)運(yùn)體參與攝取并維持突觸間隙的神經(jīng)遞質(zhì)水平如谷

3、氨酸(glutamate，Glu)和γ-氨基丁酸。研究表明，由Glu介導(dǎo)的興奮性毒性作用在PD病變中發(fā)揮主要作用。突觸間隙Glu清除和失活的主要途徑是通過星形膠質(zhì)細(xì)胞上高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamatetransporters，GluTs)對Glu的主動重?cái)z取，星形膠質(zhì)細(xì)胞上GluTs對維持突觸間隙Glu正常濃度，對PD的治療具有重要意義。 Glu通過Glu受體而發(fā)揮不同的生理作用。Glu受體分為親離子型谷氨酸受體(ion

4、otropicglutamatereceptor,iGluRs)和親代謝型谷氨酸受體(metabotropicglutamatereceptors，mGluRs)兩大類。其中，mGluRs被認(rèn)為是研發(fā)治療PD藥物的有益靶標(biāo)，證據(jù)如下：1)mGluRs在與PD發(fā)病相關(guān)的基底神經(jīng)節(jié)(basalganglia，BG)核團(tuán)高水平表達(dá)；2)mGluRs參與調(diào)節(jié)與PD發(fā)病密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)的信號傳遞，如Glu和DA的釋放等；3)選擇性激動mGluR

5、s保護(hù)PD病理模型中DA能神經(jīng)元；4)本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)給予Ⅱ、Ⅲ組mGluRs激動劑能減輕6-OHDA單側(cè)損毀PD模型中DA能神經(jīng)元的損傷，緩解PD癥狀。因而，選擇性調(diào)節(jié)mGluRs的功能對PD治療具有重要價值。深入研究發(fā)現(xiàn)mGluRs不僅表達(dá)在神經(jīng)元上，而且星形膠質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)mGluRs。但是，選擇性激動星形膠質(zhì)細(xì)胞上mGluRs是否能間接保護(hù)中腦神經(jīng)元。目前尚未見相關(guān)報道。 本文分別探討MPP+和LPS這兩種作用機(jī)制

6、不同的神經(jīng)毒素是否引起星形膠質(zhì)細(xì)胞上GluTs功能障礙；選擇性激動星形膠質(zhì)細(xì)胞上Ⅱ和Ⅲ組mGluRs是否可以調(diào)節(jié)PD細(xì)胞模型中GluTs功能障礙，從而保護(hù)DA能神經(jīng)元。為了解決這些問題，本文應(yīng)用原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和中腦神經(jīng)元，研究選擇性激動星形膠質(zhì)細(xì)胞上Ⅱ、Ⅲ組mGluRs對DA神能經(jīng)元的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，為PD的臨床治療提供新的思路，也為研發(fā)理想的治療PD藥物提供有益的靶標(biāo)。 本文第一部分在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞是否表達(dá)

7、Ⅱ、Ⅲ組mGluRs和MPP+是否影響GluTs功能的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討激動C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞上Ⅱ、Ⅲ組mGluRs對Glu攝取的影響；第二部分研究激動星形膠質(zhì)細(xì)胞上Ⅱ、Ⅲ組mGluRs是否調(diào)節(jié)MPP+引起的GluTs功能障礙而保護(hù)中腦神經(jīng)元及其可能作用環(huán)節(jié)；第三部分探討LPS損傷DA能神經(jīng)元的機(jī)制是否與影響與星形膠質(zhì)細(xì)胞上GluTs功能相關(guān)，并研究激動星形膠質(zhì)細(xì)胞上Ⅱ、Ⅲ組mGluRs對LPS毒素導(dǎo)致中腦DA神經(jīng)元損傷的影響。

8、 第一部分激動C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞上Ⅱ、Ⅲ組mGluRs對MPP+抑制谷氨酸攝取的影響 目的：在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞是否表達(dá)Ⅱ、Ⅲ組mGluRs的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討激動C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞上Ⅱ、Ⅲ組mGluRs對MPP+抑制Glu攝取的影響。 方法：同位素標(biāo)記法測定C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞對Glu的攝??；顯微鏡下觀察C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)變化；Annexin-Ⅴ染色法和流式細(xì)胞術(shù)兩種不同方法檢測C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，四氮唑(MTT)比色法檢測C6膠質(zhì)

9、瘤細(xì)胞活性。應(yīng)用Westem-blotting、RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞上表達(dá)Ⅱ、Ⅲ組mGluRs。 結(jié)果：1)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)Ⅱ組(mGluR3)和Ⅲ組mGluRs(mGluR4，mGluR6，mGluR7和mGluR8)。 2)不同濃度的MPP+(50，100，150μM)對細(xì)胞活性、形態(tài)和凋亡均無顯著影響，但能不同程度地顯著抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞攝取Glu。 3)MPP+抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)

10、胞攝取Glu，Ⅱ組mGluRs激動劑DCG-Ⅳ，APDC和Ⅲ組mGluRs激動劑L-AP4均能逆轉(zhuǎn)MPP+對Glu攝取的抑制作用，這種逆轉(zhuǎn)作用可分別被Ⅱ組和Ⅲ組mGluRs拮抗劑APICA，LY341495和MSOP所拮抗。 結(jié)論：C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞上表達(dá)Ⅱ組mGluRs(mGluR3)和Ⅲ組mGluRs(mGluR4，mGluR6，mGluR7和mGluR8)。激動C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞上的Ⅱ、Ⅲ組mGluRs可逆轉(zhuǎn)MPP+引起的Glu攝

11、取抑制。 第二部分激動星形膠質(zhì)細(xì)胞上Ⅱ、Ⅲ組mGluRs對MPP+致中腦神經(jīng)元損傷的影響及其機(jī)制研究 目的：研究激動星形膠質(zhì)細(xì)胞上Ⅱ、Ⅲ組mGluRs是否可保護(hù)中腦神經(jīng)元免受MPP+活化星形膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致的神經(jīng)毒性的損傷及其相關(guān)機(jī)制。 方法：原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)和中腦神經(jīng)元；應(yīng)用Western-blotting檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞上iNOS表達(dá)；應(yīng)用Annexin-Ⅴ法檢測中腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率；同位素標(biāo)記法測定膠質(zhì)細(xì)胞對G

12、lu的攝??；HPLC-熒光檢測法測定星形膠質(zhì)細(xì)胞胞外Glu水平。 結(jié)果：1)MPP+(150μM)與中腦神經(jīng)元共同孵育48h，并不能使中腦神經(jīng)元的凋亡率顯著增加，而經(jīng)MPP+(150μM)處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基顯著促進(jìn)中腦神經(jīng)元凋亡。 2)預(yù)先用Ⅱ、Ⅲ組mGluRs激動劑DCG-Ⅳ和L-AP4與神經(jīng)元預(yù)孵育，不降低MPP+導(dǎo)致的中腦神經(jīng)元的凋亡。但DCG-Ⅳ和L-AP4與星形膠質(zhì)細(xì)胞預(yù)孵育制備的條件培養(yǎng)基顯著降低MP

13、P+引起的中腦神經(jīng)元的凋亡，這種作用可被Ⅱ、Ⅲ組mGluRs拮抗劑APICA和MSOP所拮抗。 3)MPP+抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取Glu，DCG-Ⅳ，APDC和L-AP4均能逆轉(zhuǎn)MPP+對Glu攝取的抑制作用，這種逆轉(zhuǎn)作用分別被Ⅱ組和Ⅲ組mGluRs拮抗劑APICA，LY341495和MSOP所拮抗。 4)iNOS抑制劑氨基胍可取消MPP+對Glu攝取的抑制作用，提示NO通路參與調(diào)節(jié)Glu攝取。 5)MPP+誘導(dǎo)星

14、形膠質(zhì)細(xì)胞iNOS表達(dá)和生成NO，DCG-Ⅳ和L-AP4均能逆轉(zhuǎn)MPP+引起的iNOS表達(dá)和NO生成，這種逆轉(zhuǎn)作用可分別被Ⅱ組、Ⅲ組mGluRs拮抗劑APICA和MSOP所拮抗。 結(jié)論：激動星形膠質(zhì)細(xì)胞上的Ⅱ、Ⅲ組mGluRs通過抑制iNOS表達(dá)、NO生成，增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取Glu而保護(hù)中腦神經(jīng)元免受MPP+活化星形膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致的神經(jīng)毒性作用。 第三部分激動星形膠質(zhì)細(xì)胞上Ⅱ、Ⅲ組mGluRs對LPS致中腦神經(jīng)元損傷的影

15、響及其機(jī)制研究 目的：研究LPS是否影響星形膠質(zhì)細(xì)胞GluTs的功能，進(jìn)一步探討激動星形膠質(zhì)細(xì)胞上Ⅱ和Ⅲ組mGluRs是否通過調(diào)節(jié)GluTs功能抑制LPS對中腦神經(jīng)元的損傷。 方法：應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測TH陽性神經(jīng)元存活率；應(yīng)用Annexin-Ⅴ法檢測中腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率；同位素標(biāo)記法測定Glu攝??；HPLC-熒光檢測法測定胞外Glu水平。 結(jié)果：1)LPS(4μg/ml)與中腦神經(jīng)元共同孵育48h，并不能使中

16、腦神經(jīng)元的凋亡率顯著增加，而經(jīng)LPS(4μg/ml)處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基顯著促進(jìn)神經(jīng)元凋亡。 2)預(yù)先用Ⅱ、Ⅲ組mGluRs激動劑DCG-Ⅳ和L-AP4與神經(jīng)元預(yù)孵育，不降低LPS引起的中腦神經(jīng)元的凋亡，但DCG-Ⅳ和L-AP4與星形膠質(zhì)細(xì)胞預(yù)孵育制備的條件培養(yǎng)基顯著降低LPS所致的中腦神經(jīng)元的凋亡，這種作用可被Ⅱ、Ⅲ組mGluRs拮抗劑APICA和MSOP所拮抗。 3)LPS抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取Glu，DCG-Ⅳ

17、，APDC和L-AP4均能逆轉(zhuǎn)LPS引起的Glu攝取抑制，這種逆轉(zhuǎn)作用分別被Ⅱ和Ⅲ組mGluRs拮抗劑APICA，LY341495和MSOP所拮抗。 4)谷胱甘肽(glutathione，GSH)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetvlcysteine，NAC)能夠取消LPS對Glu攝取的抑制作用，提示活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)信號傳導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)Glu攝取。 5)LPS降低星形膠質(zhì)細(xì)胞胞