姜黃素對(duì)Aβ-,25-35-誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一種在老年期常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶、認(rèn)知功能減退和精神障礙。AD的主要病理特征是在基底前腦、海馬和大腦皮層部位細(xì)胞外的老年斑（senile plaques，SP）和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT），并伴有突觸和神經(jīng)元的缺失。 Β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein, Aβ）是構(gòu)成AD特

2、征性病理改變老年斑的核心成分。大量研究證實(shí)Aβ尤其是聚合成纖維形式的Aβ對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞及在體神經(jīng)細(xì)胞有毒性作用，主要毒性片段為Aβ25-35，表現(xiàn)在破壞細(xì)胞膜的完整性、擾亂細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及觸發(fā)氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡等方面。神經(jīng)病理學(xué)研究表明，AD患者腦中神經(jīng)元的凋亡率比正常人高30-50倍，細(xì)胞凋亡在AD發(fā)病中具有重要作用，是AD神經(jīng)元喪失的原因之一。因此，探求可以有效對(duì)抗Aβ25-35神經(jīng)毒性的藥物對(duì)于AD的治療是非常必

3、須的。 姜黃素（Curcumin）是從姜黃中提取得到的主要有效成分，一直作為食品添加劑為人們所普遍利用。大量研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等生理和藥理作用。近年來(lái)，姜黃素對(duì)于AD的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注，但具體機(jī)制尚不明確。 本課題在此基礎(chǔ)上建立Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型，同時(shí)應(yīng)用姜黃素對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，觀察其拮抗Aβ25-35的毒性的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。 本課題分兩部分。

4、 第一部分：研究Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用。 選用Aβ25-35 誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞作為AD的細(xì)胞模型，四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測(cè)定不同濃度Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響，應(yīng)用Annexin V-PI染色通過(guò)流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顯微鏡下觀察正常對(duì)照組PC12細(xì)胞體積較大，神經(jīng)突起明顯且長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)快，密度大，細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)。加入Aβ25-35 24h后，細(xì)胞數(shù)量減少，體積變小，

5、突起減少變短，細(xì)胞貼壁能力減弱，隨著Aβ25-35劑量的加大，細(xì)胞明顯變小變圓，突起漸消失。MTT活性測(cè)定顯示隨著Aβ25-35濃度的增加，細(xì)胞活性逐漸下降，在Aβ25-35為20μmol/L時(shí)細(xì)胞活力開(kāi)始明顯下降（P<0.01），隨著劑量逐漸加大，細(xì)胞活性進(jìn)一步降低，呈劑量依賴(lài)，各濃度組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P<0.05）。Annexin-V/PI染色后熒光顯微鏡觀察到Aβ25-35處理過(guò)的PC12細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡征象，早期

6、的凋亡細(xì)胞只出現(xiàn)細(xì)胞膜染色而細(xì)胞核未被染色，晚期的凋亡細(xì)胞則細(xì)胞膜和細(xì)胞核同時(shí)染色。 第二部分：姜黃素拮抗Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用及其可能的機(jī)制。 選用PC12細(xì)胞，給予合適濃度的Aβ25-35和姜黃素，通過(guò)MTT，流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡、Western Blot等方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果顯示，在倒置顯微鏡下觀察到20μmol/L Aβ25-35處理組細(xì)胞形態(tài)與正常組比較，細(xì)胞體積變小，突起減少變短，細(xì)

7、胞貼壁能力減弱，而經(jīng)過(guò)5μmol/L姜黃素處理后，細(xì)胞形態(tài)逐漸變大，突起也有恢復(fù)，細(xì)胞貼壁能力也增強(qiáng)。MTT結(jié)果顯示姜黃素具有拮抗Aβ25-35毒性的作用，在姜黃素濃度為5μmol/L細(xì)胞活力最高（P<0.01），隨著劑量逐漸加大，細(xì)胞活性開(kāi)始降低，表明姜黃素在一定劑量范圍具有保護(hù)作用。熒光顯微鏡下觀察，正常組幾乎沒(méi)有凋亡細(xì)胞，偶見(jiàn)零星散在的早期凋亡細(xì)胞，即細(xì)胞膜染成綠色環(huán)狀而細(xì)胞核未被染色；經(jīng)20μmol/L Aβ25-35處理過(guò)的P

8、C12細(xì)胞則出現(xiàn)較多典型的細(xì)胞凋亡征象，不僅可見(jiàn)早期凋亡細(xì)胞同時(shí)可見(jiàn)晚期的凋亡細(xì)胞，即胞膜和胞核同時(shí)染色，細(xì)胞膜染成綠色環(huán)狀，胞核染成紅色；而經(jīng)5μmol/L姜黃素同時(shí)處理的PC12細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Aβ25-35處理組的細(xì)胞凋亡率明顯增高，與正常細(xì)胞相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01；而姜黃素處理組細(xì)胞凋亡率有明顯的下降，與Aβ25-35處理組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。表明姜黃素可以保護(hù)PC12細(xì)胞，使細(xì)胞

9、的凋亡率明顯下降。線(xiàn)粒體膜電位的測(cè)定結(jié)果表明，正常情況下，由于線(xiàn)粒體膜電位高，JC-1聚集發(fā)出紅色熒光；用20μmol/L Aβ25-35處理后，PC12細(xì)胞線(xiàn)粒體膜受損，JC-1進(jìn)入減少，正常的紅色熒光逐漸被單體的綠色熒光代替，且細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生變化；姜黃素處理組細(xì)胞雖然形態(tài)未恢復(fù)正常的狀態(tài)，但紅色熒光明顯比Aβ25-35處理組濃度高。表明姜黃組處理組的線(xiàn)粒體膜電位較Aβ25-35處理組有明顯恢復(fù)，提示姜黃素可拮抗Aβ25-35所致的氧

10、化應(yīng)激的增加，保護(hù)線(xiàn)粒體膜，減少其損傷。 對(duì)caspase-3和p-JNK的檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)Aβ25-35處理的細(xì)胞與正常細(xì)胞比，caspase-3前體蛋白明顯減少，p-JNK表達(dá)增高，與正常細(xì)胞比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01；而經(jīng)過(guò)姜黃素同時(shí)處理的PC12細(xì)胞，caspase-3前體蛋白表達(dá)高于Aβ25-35處理組，p-JNK表達(dá)低于Aβ25-35處理組，與Aβ25-35處理組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01，表明在Aβ25-

11、35的作用下，PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡，其與caspase-3蛋白和p-JNK的表達(dá)有關(guān)，而姜黃素處理可以抑制p-JNK的活化，減少caspase-3蛋白的降解，從而減少細(xì)胞凋亡，達(dá)到保護(hù)生存的目的。 上述結(jié)果表明： 1、Aβ25-35可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，主要表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)和細(xì)胞凋亡率的變化。 2、姜黃素可拮抗Aβ25-35的毒性作用，提高Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的活性，降低Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞