促紅細(xì)胞生成素對(duì)Aβ-,25-35-致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：促紅細(xì)胞生成素對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　 目的：Aβ25-35處理PC12細(xì)胞制備AD細(xì)胞模型，觀察EPO對(duì)Aβ25-35所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率；Hoechst33342熒光染色法及TUNEL法觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)的改變；AnnexinV-PI雙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；分子探針DCFH-DA

2、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平；羅丹明123標(biāo)記線粒體熒光分光光度計(jì)檢測(cè)線粒體膜電位水平；Western Blot檢測(cè)PC12細(xì)胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)不同濃度的Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制作用，且隨著Aβ25-35濃度的增加，細(xì)胞活力受到抑制的程度也逐漸增加。當(dāng)Aβ25-35濃度為20μmol/L時(shí)，PC12細(xì)胞存活率僅為對(duì)照組的62.6%。與對(duì)照組比較有極顯著差異。(

3、2)2U/mlEPO可明顯減輕20μmol/L Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞存活率的抑制，細(xì)胞存活率為96.7±10.7%。(3)在TUNEL法和Hochest熒光染色法實(shí)驗(yàn)中，從形態(tài)學(xué)上觀察EPO對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，Annexin Ⅴ-P I標(biāo)記的流式細(xì)胞儀分析亦對(duì)EPO的抗凋亡作用進(jìn)行了定量檢測(cè)，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示：20μmol/LAβ25-35導(dǎo)致PC12細(xì)胞凋亡，給予2U/ml EPO預(yù)處理1h可使PC

4、12細(xì)胞的凋亡百分率顯著降低。(4)20μmol/LAβ25-35導(dǎo)致PC12細(xì)胞ROS含量增加，線粒體膜電位耗散，Bcl-2/Bax比值降低及caspase-3活性增強(qiáng)；EPO可以抑制Aβ25-35導(dǎo)致的以上變化。
　　 結(jié)論：Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞具有氧化損傷及誘導(dǎo)凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)EPO通過(guò)抗氧化、抗凋亡機(jī)制對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。
　　 第二部分：JAK2/STAT5信號(hào)通路

5、在EPO抗Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷中的作用
　　 目的：探討JAK2/STAT5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EPO對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)中的作用。
　　 方法：(1)2U/mlEPO和20μmol/L的Aβ25-35共孵育后15min、30mim及60min 收集細(xì)胞。采用Western Blot方法檢測(cè)JAK2、p-JAK2、STAT5及p-STAT5蛋白的表達(dá)；(2)在EPO處理前給予該通路的特異性抑制劑

6、AG490，采用Western Blot方法檢測(cè)JAK2、p-JAK2、STAT5及p-STAT5蛋白的表達(dá)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；TUNEL和Hoechst33342熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡的改變。
　　 結(jié)果：(1)EPO可快速激活JAK2蛋白和STAT5蛋白，其中p-JAK2在15min表達(dá)最明顯，60min內(nèi)還可見(jiàn)持續(xù)表達(dá)，組間蛋白表達(dá)量有顯著性差異，而p-STAT5于15min時(shí)表達(dá)增加，30min達(dá)峰值，60min仍

7、持續(xù)表達(dá)。(2)在EPO處理前給予該通路的特異性抑制劑AG490能有效阻斷EPO誘導(dǎo)的JAK2的活化及STAT5的酪氨酸磷酸化。AG490還可拮抗EPO的細(xì)胞保護(hù)作用，使PC12細(xì)胞存活率降低，凋亡細(xì)胞數(shù)量增加。
　　 結(jié)論：JAK2/STAT5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了EPO對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　 第三部分：PI3K/Akt信號(hào)通路在EPO抗Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷中的作用
　　

8、 目的：Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡制備AD細(xì)胞模型，探討PI3K/Akt信號(hào)通路在EPO抗Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷中的作用。
　　 方法：采用Western Blot方法檢測(cè)Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β及Bcl-2蛋白的表達(dá)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；TUNEL法和Hoechst33342熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。
　　 結(jié)果：(1)2U/mlEPO與20μmol/L Aβ

9、25-35共孵育時(shí)，p-Akt表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性升高。EPO+Aβ組與對(duì)照組比較有顯著性差異。給予PI3K抑制劑LY294002后p-Akt表達(dá)水平顯著降低。此外，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在給予PI3K抑制劑LY294002的情況下，EPO對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用被明顯抑制，TUNEL和Hoechst實(shí)驗(yàn)也顯示，LY294002可使EPO+Aβ25-35組的細(xì)胞凋亡率顯著升高。(2)EPO使Akt下游靶蛋白GSK-3β磷酸化而