促紅細胞生成素對Aβ-,25-35-致PC12細胞損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：促紅細胞生成素對Aβ25-35致PC12細胞損傷的保護作用
　　 目的：Aβ25-35處理PC12細胞制備AD細胞模型，觀察EPO對Aβ25-35所致PC12細胞損傷的保護作用，并探討其相關(guān)機制。
　　 方法：采用MTT比色法檢測細胞存活率；Hoechst33342熒光染色法及TUNEL法觀察凋亡細胞形態(tài)的改變；AnnexinV-PI雙染色檢測細胞凋亡率；分子探針DCFH-DA

2、檢測細胞內(nèi)活性氧的水平；羅丹明123標記線粒體熒光分光光度計檢測線粒體膜電位水平；Western Blot檢測PC12細胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達。
　　 結(jié)果：(1)不同濃度的Aβ25-35對PC12細胞的生長產(chǎn)生明顯抑制作用，且隨著Aβ25-35濃度的增加，細胞活力受到抑制的程度也逐漸增加。當Aβ25-35濃度為20μmol/L時，PC12細胞存活率僅為對照組的62.6%。與對照組比較有極顯著差異。(

3、2)2U/mlEPO可明顯減輕20μmol/L Aβ25-35對PC12細胞存活率的抑制，細胞存活率為96.7±10.7%。(3)在TUNEL法和Hochest熒光染色法實驗中，從形態(tài)學上觀察EPO對Aβ25-35致PC12細胞凋亡的保護作用，Annexin Ⅴ-P I標記的流式細胞儀分析亦對EPO的抗凋亡作用進行了定量檢測，以上實驗結(jié)果均顯示：20μmol/LAβ25-35導致PC12細胞凋亡，給予2U/ml EPO預處理1h可使PC

4、12細胞的凋亡百分率顯著降低。(4)20μmol/LAβ25-35導致PC12細胞ROS含量增加，線粒體膜電位耗散，Bcl-2/Bax比值降低及caspase-3活性增強；EPO可以抑制Aβ25-35導致的以上變化。
　　 結(jié)論：Aβ25-35對PC12細胞具有氧化損傷及誘導凋亡的作用。本實驗證實EPO通過抗氧化、抗凋亡機制對Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷發(fā)揮保護效應。
　　 第二部分：JAK2/STAT5信號通路

5、在EPO抗Aβ25-35致PC12細胞損傷中的作用
　　 目的：探討JAK2/STAT5信號轉(zhuǎn)導通路在EPO對Aβ25-35致PC12細胞損傷的保護中的作用。
　　 方法：(1)2U/mlEPO和20μmol/L的Aβ25-35共孵育后15min、30mim及60min 收集細胞。采用Western Blot方法檢測JAK2、p-JAK2、STAT5及p-STAT5蛋白的表達；(2)在EPO處理前給予該通路的特異性抑制劑

6、AG490，采用Western Blot方法檢測JAK2、p-JAK2、STAT5及p-STAT5蛋白的表達；MTT法檢測細胞存活率；TUNEL和Hoechst33342熒光染色法觀察細胞凋亡的改變。
　　 結(jié)果：(1)EPO可快速激活JAK2蛋白和STAT5蛋白，其中p-JAK2在15min表達最明顯，60min內(nèi)還可見持續(xù)表達，組間蛋白表達量有顯著性差異，而p-STAT5于15min時表達增加，30min達峰值，60min仍

7、持續(xù)表達。(2)在EPO處理前給予該通路的特異性抑制劑AG490能有效阻斷EPO誘導的JAK2的活化及STAT5的酪氨酸磷酸化。AG490還可拮抗EPO的細胞保護作用，使PC12細胞存活率降低，凋亡細胞數(shù)量增加。
　　 結(jié)論：JAK2/STAT5信號轉(zhuǎn)導通路參與了EPO對Aβ25-35致PC12細胞損傷的保護作用。
　　 第三部分：PI3K/Akt信號通路在EPO抗Aβ25-35誘導PC12細胞損傷中的作用
　　

8、 目的：Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡制備AD細胞模型，探討PI3K/Akt信號通路在EPO抗Aβ25-35誘導PC12細胞損傷中的作用。
　　 方法：采用Western Blot方法檢測Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β及Bcl-2蛋白的表達；MTT法檢測細胞存活率；TUNEL法和Hoechst33342熒光染色法觀察細胞凋亡的形態(tài)學改變。
　　 結(jié)果：(1)2U/mlEPO與20μmol/L Aβ

9、25-35共孵育時，p-Akt表達水平呈時間依賴性升高。EPO+Aβ組與對照組比較有顯著性差異。給予PI3K抑制劑LY294002后p-Akt表達水平顯著降低。此外，MTT法檢測細胞存活率實驗發(fā)現(xiàn)：在給予PI3K抑制劑LY294002的情況下，EPO對PC12細胞的保護作用被明顯抑制，TUNEL和Hoechst實驗也顯示，LY294002可使EPO+Aβ25-35組的細胞凋亡率顯著升高。(2)EPO使Akt下游靶蛋白GSK-3β磷酸化而