NF-κB與鉛致PC12細(xì)胞毒性作用關(guān)系的研究.pdf

1、鉛是一種廣泛存在于環(huán)境，嚴(yán)重危害人類健康的重金屬元素。在工業(yè)化迅猛發(fā)展的今天，在我們的日常生活中鉛可謂無(wú)處不在，溶混在大氣、土壤、塵埃、水、日用品、裝飾材料、玩具、學(xué)習(xí)用品中，甚至在食品、中藥材中也有它們的身影。鉛對(duì)神經(jīng)、造血、消化、泌尿、生殖和發(fā)育、心血管、內(nèi)分泌、免疫、骨骼等各類器官均有不良影響。低水平鉛暴露(≤100g/L)即能干擾血紅素的合成，引起腸道鐵離子吸收障礙，產(chǎn)生缺鐵性貧血。更為嚴(yán)重的是它影響嬰幼兒和兒童發(fā)育的中樞神經(jīng)系

2、統(tǒng)，從而造成智力、記憶力、神經(jīng)行為的障礙。鉛容易通過(guò)胎盤和血腦屏障，胎兒腦對(duì)血鉛易感。鉛可通過(guò)臍帶或母乳垂直傳播。研究發(fā)現(xiàn)，鉛可直接作用于人體的海馬和大腦皮層，導(dǎo)致認(rèn)知缺陷和智力下降。慢性低水平的鉛暴露不但影響兒童的智力發(fā)育，還影響學(xué)習(xí)行為和聽(tīng)覺(jué)等多方面的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程，其影響是長(zhǎng)遠(yuǎn)和嚴(yán)重的。
　　 有關(guān)鉛的神經(jīng)毒性作用的研究很多，但至今對(duì)其神經(jīng)毒作用的分子機(jī)制仍不清楚。已有研究表明，NF-κB在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程和基因表達(dá)調(diào)控

3、中具有重要的作用，而目前有關(guān)鉛對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響的研究未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬從分子水平上探討NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與鉛的神經(jīng)毒作用的關(guān)系。研究PC12細(xì)胞在低劑量鉛暴露情況下，其核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、p53基因及Bcl-2基因的變化，并探討這種變化與鉛的神經(jīng)毒性的內(nèi)在聯(lián)系。本研究分兩部分，研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　 第一部分：醋酸鉛對(duì)PC12細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性影響研究
　　 目的：探

4、討醋酸鉛及NF-κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(NF-κ B)轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　 方法：將大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)暴露于不同濃度的醋酸鉛0 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L、1600 μmol/L，采用四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)(MTT）檢測(cè)IC50值。

5、用脂質(zhì)體將pNF-κ B-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PC12細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的PC12細(xì)胞分別暴露于不同濃度的醋酸鉛(100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L)及不同濃度醋酸鉛加PDTC100 μmol/L，24小時(shí)后采用螢光素酶(Luciferase)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)螢光素酶活性。
　　 結(jié)果：用不同濃度的醋酸鉛處理細(xì)胞24小時(shí)，其生長(zhǎng)增殖受到不同程度的抑制，且呈現(xiàn)出劑量反應(yīng)關(guān)系，其IC50值為(533.966

6、±100.830)μmol/L。用不同濃度的醋酸鉛處理轉(zhuǎn)染后的PC12細(xì)胞24小時(shí)，結(jié)果顯示：PDTC對(duì)照組螢光素酶活性較空白對(duì)照組降低(P<0.01)；鉛處理組螢光素酶活性較空白對(duì)照組高(P<0.01)，且具有劑量依賴性；
　　 鉛+PDTC聯(lián)合作用組與PDTC對(duì)照組相比，PC12細(xì)胞內(nèi)螢光素酶活性增高(P<0.01)；
　　 結(jié)論：醋酸鉛可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性升高。
　　 第二部分：NF-κB

7、，p53及Bcl-2在鉛誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡中的作用研究
　　 目的：近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)p53、Bcl-2基因在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)試圖從基因表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)水平上進(jìn)行觀察，從分子水平上探討鉛誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理。
　　 方法：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)p53、p65 mRNA的轉(zhuǎn)錄；用免疫印記的方法檢測(cè)鉛對(duì)Bcl-2 蛋白的表達(dá)；用流式細(xì)胞術(shù)研究醋酸鉛誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡情況及其分子機(jī)理

8、。
　　 結(jié)果：PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度醋酸鉛(100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L)處理24小時(shí)后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡率(n=3)，鉛組凋亡率明顯高于對(duì)照組，改變呈劑量依賴性。差異有顯著性(P<0.05)。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在404bp(β-actin)、493bp(p65)和538bp(p53)處均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)分別對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度分析。結(jié)