FP1在鉛導(dǎo)致PC12細(xì)胞內(nèi)鐵聚積中的作用研究.pdf

1、研究目的:
　　因越來越多的研究發(fā)現(xiàn)鉛可以引起阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD),使得鉛的神經(jīng)毒性再次備受關(guān)注成為熱點(diǎn)問題之一,然而其機(jī)制仍未完全明了。在我們前期研究的長期鉛暴露動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)鉛可以引起老年大鼠腦鐵過載。眾所周知,腦鐵過載是阿爾茲海默病的病因。因此,我們有理由認(rèn)為鉛引起鐵過載進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病。然而,鉛是通過何種途徑或機(jī)制引起腦鐵過載尚不清楚。故本研究建立體外培養(yǎng)的大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻

2、瘤細(xì)胞系即PC12細(xì)胞鉛暴露模型,探討鉛暴露對細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的影響及鐵轉(zhuǎn)入蛋白二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(divalent metal transporter1, DMT1)和鐵轉(zhuǎn)出蛋白膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin1, FP1)在其中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　(1)PC12細(xì)胞置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),分別在不同鐵環(huán)境下(正常鐵環(huán)境、10μM硫酸亞鐵、100μM去鐵胺)以濃度梯度(0μM、0.01μM、0.1μM

3、、1μM、10μM、100μM)的醋酸鉛處理細(xì)胞24、48和72小時(shí)(h)后,使用鐵染色(Perl’s staining)檢測細(xì)胞內(nèi)鐵水平的變化,使用MTT法檢測細(xì)胞活力變化。
　　(2)濃度梯度(0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM)的醋酸鉛分別處理細(xì)胞24、48和72 h后,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)( reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT

4、-PCR)檢測細(xì)胞DMT1和FP1 mRNA表達(dá)水平的變化,使用免疫蛋白印跡法(western blotting, WB)檢測細(xì)胞DMT1和FP1蛋白表達(dá)水平的變化。
　　(3)用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將pFP1-EGFP-N1質(zhì)粒和pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)入細(xì)胞,并通過觀察綠色熒光蛋白GFP陽性細(xì)胞和免疫熒光法(Immunofluorescent, IF)檢測FP1表達(dá)變化以評估轉(zhuǎn)染效果。
　　(4)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,再用10μM醋酸鉛

5、處理24 h,使用鐵染色(Perl’s staining)和鐵熒光檢測法(Iron fluorescence detection)檢測細(xì)胞內(nèi)鐵水平的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　(1)鉛暴露引起PC12細(xì)胞內(nèi)鐵含量增加:Perl’s鐵染色發(fā)現(xiàn),鉛暴露后PC12細(xì)胞內(nèi)鐵水平增加,且隨著鉛暴露濃度和時(shí)間增加呈劑量反應(yīng)關(guān)系。高鐵環(huán)境能加重鉛引起的細(xì)胞內(nèi)鐵聚積。
　　(2)鉛暴露引起PC12細(xì)胞活力下降:MTT檢測顯示在鉛暴露2

6、4 h后,PC12細(xì)胞活力在不同鐵環(huán)境下的各濃度鉛暴露組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在鉛暴露48和72 h后,PC12細(xì)胞活力下降,且隨著鉛暴露濃度和時(shí)間的增加呈劑量反應(yīng)關(guān)系。此外,在高鐵環(huán)境下,這種劑量反應(yīng)下降表現(xiàn)更為嚴(yán)重。
　　(3)鉛暴露影響DMT1的表達(dá):RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),DMT1(-IRE)表達(dá)水平僅在高濃度(100μM)鉛暴露24 h后較對照組上升(P<0.05)。DMT1(+IRE) mRNA表達(dá)水平

7、在鉛暴露24 h后,隨著鉛濃度增加呈現(xiàn)劑量反應(yīng)上升,而在鉛暴露48和72 h后,隨著鉛濃度增加呈現(xiàn)劑量反應(yīng)下降(P<0.05)。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),在鉛暴露24 h后,PC12細(xì)胞DMT1蛋白表達(dá)水平增加,且隨著鉛暴露濃度增加呈劑量反應(yīng)關(guān)系。但隨著鉛暴露時(shí)間延長至72 h后,PC12細(xì)胞DMT1蛋白表達(dá)水平降低,且隨著鉛暴露濃度增加呈劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　(4)鉛暴露引起FP1的表達(dá)下降:RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),

8、僅在鉛暴露72 h后, PC12細(xì)胞FP1 mRNA表達(dá)水平在10-100μM鉛暴露組較對照組降低(P<0.05)。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),在鉛暴露24、48和72 h后, PC12細(xì)胞內(nèi)FP1的蛋白表達(dá)水平降低,且隨著鉛暴露濃度和時(shí)間增加呈劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　(5)FP1高表達(dá)減輕鉛暴露后細(xì)胞內(nèi)鐵聚積的程度:PC12細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染FP1質(zhì)粒和空載后,免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組FP1蛋白表達(dá)水平增加為空載轉(zhuǎn)染

9、對照組的3.3倍(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞用10μM醋酸鉛處理24 h, Perl’s鐵染色發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)鐵水平是空載轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞內(nèi)鐵水平的0.4倍(P<0.05)。鐵熒光檢測發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)鐵水平是空載轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞內(nèi)鐵水平的0.33倍(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　鉛暴露引起PC12細(xì)胞內(nèi)鐵聚積是下調(diào)FP1表達(dá)水平所致,而可能與DMT1表達(dá)水平變化無關(guān)。故FP1可能成為阻止鉛引起神經(jīng)細(xì)胞鐵過載及隨后