尿酸對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)α-synuclein降解和自噬的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分尿酸對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)α-synuclein蛋白影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：評(píng)價(jià)尿酸對(duì)PC12細(xì)胞中α-synuclein(α-syn)蛋白的作用。
　　方法：建立慢病毒轉(zhuǎn)染的過(guò)表達(dá)α-syn的WT-PC12細(xì)胞株（WT細(xì)胞）。在過(guò)表達(dá)α-syn的WT-PC12細(xì)胞中加入尿酸（0-200μmol/L），檢測(cè)細(xì)胞活力及α-syn蛋白。建立魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型，0-500nM的魚(yú)藤酮作用12小時(shí)后檢測(cè)α-syn蛋白。在魚(yú)

2、藤酮模型中，尿酸預(yù)處理1h,觀察α-syn蛋白。在高分化PC12細(xì)胞中測(cè)定尿酸作用6h后，α-syn轉(zhuǎn)錄情況。為了觀察尿酸對(duì)α-syn半衰期的影響，使用蛋白抑制劑CHX單獨(dú)作用以及與尿酸共同作用0-12h，對(duì)比尿酸對(duì)α-syn半衰期的影響。
　　結(jié)果：200umol/L尿酸可以有效降低α-syn蛋白，這一結(jié)果在魚(yú)藤酮模型中進(jìn)一步得到驗(yàn)證。PCR檢測(cè)到尿酸對(duì)α-syn mRNA無(wú)明顯。對(duì)比蛋白合成抑制劑CHX（cycloheximi

3、de）單獨(dú)作用，加入尿酸之后，α-syn的降解速度增加，進(jìn)一步證明尿酸可以促進(jìn)α-syn降解。
　　結(jié)論：尿酸可以促進(jìn)PC12細(xì)胞中α-syn的降解。
　　第二部分尿酸對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)自噬的調(diào)控作用及機(jī)制研究
　　目的：探討尿酸在PC12細(xì)胞中對(duì)自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法：首先在PC12細(xì)胞中加入尿酸（0-200μmol/L），12小時(shí)后用Western blot檢測(cè)p62、LC3蛋白。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染eGFP-LC3質(zhì)

4、粒，尿酸100μmol/L、200μmol/L作用后，對(duì)比空白對(duì)照組觀察LC3點(diǎn)狀熒光表達(dá)分布的狀況。魚(yú)藤酮作用PC12細(xì)胞,建立帕金森病細(xì)胞模型，觀察LC3含量。在魚(yú)藤酮模型中，分為對(duì)照組、魚(yú)藤酮組（50nmol/L）、尿酸（100μmol/L）+魚(yú)藤酮（50nmol/L）組、尿酸（200μmol/L）+魚(yú)藤酮（50nmol/L）組，觀察p62、LC3含量以及eGFP-LC3點(diǎn)狀熒光。分別檢測(cè)對(duì)照組、氯喹（30μmol/L）組、尿酸（

5、200μmol/L）組、氯喹（30μmol/L）+尿酸（200μmol/L）組LC3含量。采用Western blot觀察mTOR依賴通路蛋白mTOR和p70S6K及其磷酸化水平變化。
　　結(jié)果：尿酸（0-200μmol/L）作用之后，可以觀察到胞內(nèi)LC3含量呈劑量依賴性增加，同時(shí)胞內(nèi)p62的含量也逐漸減少。在eGFP-LC3轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞中，與空載組相比，作用200μM尿酸組，在熒光顯微鏡下明顯觀察到綠色點(diǎn)狀熒光增加。50

6、nmol/L魚(yú)藤酮作用12h后可以發(fā)現(xiàn)LC3II水平明顯下降，同時(shí)對(duì)細(xì)胞活力未有明顯影響。在魚(yú)藤酮模型中，100μmol/L及200μmol/L尿酸預(yù)給藥1小時(shí)，尿酸可以逆轉(zhuǎn)魚(yú)藤酮導(dǎo)致的LC3下降及p62增加的現(xiàn)象。免疫熒光實(shí)驗(yàn)：與單獨(dú)魚(yú)藤酮作用組相比，預(yù)給藥尿酸組eGFP-LC3熒光點(diǎn)的數(shù)量增加。30μmol/L CQ作用明顯增加了胞內(nèi)LC3II的水平，尿酸作用之后，LC3II含量較前明顯增高。磷酸化的mTOR以及其下游的p70s6k