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文檔簡介
1、目的:
1.探討麥芽酚鋁對PC12細(xì)胞TNFR1、RIP1及RIP3的影響。
2.通過分別干擾TNFR1、RIP1及RIP3,進(jìn)一步探討TNFR1、RIP1及RIP3在麥芽酚鋁致PC12細(xì)胞程序性壞死中的調(diào)控作用。
方法:
1.培養(yǎng)PC12細(xì)胞,用Z-VAD-FMK和Nec-1分別對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),并用麥芽酚鋁染毒。分別設(shè)置正常對照組、DMSO溶劑對照組、200μM Al(mal)3組、Z-VAD-
2、FMK(20μM)組、Z-VAD-FMK+Al(mal)3組、Nec-1(60μM)組和Nec-1+Al(mal)3組,繼續(xù)培養(yǎng)24h后測定各項指標(biāo):AO-EB染色觀察細(xì)胞形態(tài),CCK-8法檢測細(xì)胞活力, Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率和壞死率,qRT-PCR法檢測TNFR1、RIP1及RIP3 mRNA表達(dá)水平,Western blot法檢測TNFR1、RIP1及RIP3蛋白表達(dá)量。
2.采用siRN
3、A干擾TNFR1,Z-VAD-FMK和Nec-1處理細(xì)胞,麥芽酚鋁染毒。分別設(shè)置正常對照組、轉(zhuǎn)染陰性對照組、200μM Al(mal)3組、TNFR1 siRNA組、TNFR1 siRNA+Al(mal)3組、 TNFR1 siRNA+Z-VAD-FMK組、 TNFR1 siRNA+Z-VAD-FMK+Al(mal)3組、 TNFR1 siRNA+Nec-1組和 TNFR1 siRNA+Nec-1+Al(mal)3組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后測
4、定各項指標(biāo):CCK-8法檢測細(xì)胞活力, Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率和壞死率,qRT-PCR法檢測TNFR1、RIP1及RIP3 mRNA表達(dá)水平,Western blot法檢測TNFR1、RIP1及RIP3蛋白表達(dá)量。
3.干擾RIP1方法、分組及檢測指標(biāo)同2。
4.干擾RIP3方法、分組及檢測指標(biāo)同2。
結(jié)果:
1.麥芽酚鋁對PC12細(xì)胞的影響:(1)AO-EB染色觀
5、察細(xì)胞凋亡和壞死情況的變化:未經(jīng)麥芽酚鋁處理的各組細(xì)胞狀態(tài)良好,染色質(zhì)基本呈均勻綠染;Al(mal)3組凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞明顯增多;Z-VAD-FMK+Al(mal)3組凋亡細(xì)胞減少,壞死細(xì)胞增多;Nec-1+Al(mal)3組壞死細(xì)胞減少,凋亡細(xì)胞增多。(2)各組間細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組相比,各未染鋁組間細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),各染鋁組的細(xì)胞活力均下降(P<0.05)。與Al(mal
6、)3組相比,抑制劑處理并染鋁組細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)。(3)各組間細(xì)胞凋亡率和壞死率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組相比,染鋁后各組細(xì)胞凋亡率均增加(P<0.05), Al(mal)3組和Z-VAD-FMK+Al(mal)3組細(xì)胞壞死率均增加(P<0.05)。與Al(mal)3組相比,Z-VAD-FMK+Al(mal)3組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05),Nec-1+Al(mal)3組細(xì)胞壞死率明顯降低(P<0
7、.05)。(4)各組間 TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組相比,各染鋁組TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)增加(P<0.05), Nec-1組TNFR1蛋白表達(dá)量略有下降(P<0.05)。與Al(mal)3組相比,抑制劑處理并染鋁組TNFR1蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)。與抑制劑處理組相比,相應(yīng)抑制劑處理并染鋁組TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。(5)各組間RIP1 m
8、RNA和蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組相比,Nec-1處理后 RIP1蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.05),未經(jīng)Nec-1處理的各染鋁組的RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。與Al(mal)3組相比,Z-VAD-FMK+Al(mal)3組RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)量增加(P<0.05),Nec-1+Al(mal)3組RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)量下降(P<0.05)。與抑制劑組相比,相應(yīng)抑制
9、劑處理并染鋁組RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)。(6)各組間 RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組相比,Nec-1組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)量下降(P<0.05),各染鋁組RIP3蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)。與Al(mal)3組相比,Z-VAD-FMK+Al(mal)3組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)量增加(P<0.05),Nec-1+Al(mal)3組RIP3 mRNA和
10、蛋白表達(dá)量略有下降(P<0.05)。與抑制劑處理組相比,相應(yīng)抑制劑并染鋁組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)。
2.TNFR1 siRNA干擾對麥芽酚鋁染毒PC12細(xì)胞的影響:(1)各組間細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組相比,染鋁后各組細(xì)胞活力均明顯下降(P<0.05);與Al(mal)3組相比,凋亡、程序性壞死抑制劑處理后細(xì)胞活力增加(P<0.05)。與TNFR1siRNA組比較,干擾
11、并染鋁的各組細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)。(2)各組間細(xì)胞凋亡率和壞死率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組相比,干擾后各組中,除TNFR1 siRNA+Z-VAD-FMK組外的其余各組細(xì)胞凋亡率均增加(P<0.05),除 Nec-1+Al(mal)3外各染鋁組細(xì)胞壞死率增加(P<0.05)。與 Al(mal)3組相比,干擾后各染鋁組細(xì)胞凋亡率增加、壞死率下降(P<0.05)。與TNFR1 siRNA組相比,抑制劑處理
12、后各組細(xì)胞壞死率均下降(P<0.05)。與 TNFR1 siRNA+Al(mal)3組相比, Z-VAD-FMK+Al(mal)3組細(xì)胞凋亡率下降,壞死率增加(P<0.05),Nec-1+Al(mal)3組細(xì)胞凋亡率明顯增加,壞死率下降(P<0.05)。(3)各組間 TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組相比,TNFR1 siRNA干擾后各組TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P<0.
13、05),TNFR1基因沉默效率達(dá)70%以上。與TNFR1 siRNA組相比,干擾后各染鋁組TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)量均增加。(4)各組間RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組相比,干擾后各未染鋁組及Nec-1+Al(mal)3組RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)量均下降。與TNFR1 siRNA組相比,干擾后各未染鋁組RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)下降,各染鋁組則表達(dá)增加(P<0.05)。與TNFR
14、1 siRNA+Al(mal)3組相比,干擾后Nec-1+Al(mal)3組RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)下降。(5)各組間RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組相比,干擾后各組 RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)均降低;與TNFR1 siRNA組相比,干擾后各染鋁組RIP3 mRNA表達(dá)水平明顯上升(P<0.05), TNFR1 siRNA+Al(mal)3組RIP3蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。
15、 3.RIP1 siRNA干擾對麥芽酚鋁染毒PC12細(xì)胞的影響:(1)各組間細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組相比,Al(mal)3處理后各組的細(xì)胞活力均明顯下降(P<0.05);與Al(mal)3組相比,RIP1 siRNA干擾后染鋁組細(xì)胞活力有升高趨勢,經(jīng)抑制劑處理并染鋁的 PC12細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)。(2)各組間細(xì)胞凋亡率和壞死率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組相比,染鋁后各組細(xì)胞凋
16、亡率均增加(P<0.05),除 RIP1 siRNA+Nec-1+Al(mal)3組外各染鋁組細(xì)胞壞死率增加(P<0.05)。與Al(mal)3組相比,干擾后各染鋁組細(xì)胞凋亡率和壞死率均下降。與RIP1 siRNA組比,干擾后各染鋁組細(xì)胞凋亡率均增加(P<0.05),RIP1 siRNA+Al(mal)3組細(xì)胞壞死率升高(P<0.05)。與RIP1 siRNA+Al(mal)3組相比,抑制劑處理并染鋁組細(xì)胞凋亡率和壞死率均下降(P<0.
17、05)。(3)各組間 TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組相比,各未染鋁組TNFR1 mRNA表達(dá)無明顯變化(P>0.05),各染鋁組TNFR1 mRNA表達(dá)基本一致,均明顯增高(P<0.05);RIP1 siRNA干擾后TNFR1蛋白表達(dá)下降,其中Nec-1組下降明顯(P<0.05)。(4)各組間RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組相比,干擾后各組RIP1
18、mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯下降(P<0.05),RIP1基因沉默效率達(dá)85%以上。(5)各組間 RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組相比,干擾后各組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)量均下降(P<0.05)。與RIP1 siRNA組相比, RIP1siRNA+Nec-1組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.05),干擾后各染鋁組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)量均增加(P<0.05)。
19、4.RIP3 siRNA干擾對麥芽酚鋁染毒PC12細(xì)胞的影響:(1)各組間細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組相比,經(jīng)Al(mal)3處理后各組的細(xì)胞活力均明顯下降(P<0.05)。與Al(mal)3組相比,干擾后各染鋁組細(xì)胞活力升高(P<0.05)。與RIP3 siRNA組比較,干擾后各染鋁組細(xì)胞活力下降(P<0.05)。與抑制劑處理組相比,相應(yīng)抑制劑并染鋁組細(xì)胞活力下降(P<0.05)。(2)各組間細(xì)胞凋亡率和壞死率
20、差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組相比,各染鋁組細(xì)胞凋亡率和壞死率均顯著增加(P<0.05)。與 Al(mal)3組相比,干擾后各染鋁組細(xì)胞凋亡率均上升、壞死率下降(P<0.05)。與RIP3 siRNA組相比,Z-VAD-FMK組細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05),Nec-1組細(xì)胞壞死率下降(P<0.05),干擾后各染鋁組細(xì)胞凋亡率和壞死率增加(P<0.05)。與RIP3 siRNA+Al(mal)3組相比,抑制劑處理并染鋁組
21、細(xì)胞凋亡率無明顯變化,壞死率下降。(3)各組間TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組相比,干擾后未染鋁的各組間 TNFR1蛋白表達(dá)量無明顯變化,干擾并經(jīng)Al(mal)3處理的各組TNFR1蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)。與Al(mal)3組相比,干擾后各染鋁組TNFR1蛋白表達(dá)量均下降。(4)各組間RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組相比,干擾后未染鋁的各組
22、和Nec-1+Al(mal)3組RIP1蛋白表達(dá)下降,余各染鋁組RIP1蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。與Al(mal)3組相比,經(jīng)抑制劑和鋁處理后RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)量下降,其中Nec-1+Al(mal)3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(5)各組間 RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常對照組相比,RIP3 siRNA干擾后各組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降(P<0.05),RI
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