四氯苯醌誘導PC12細胞神經毒性的炎性有關信號通路分析.pdf

1、五氯酚(PCP)和六氯苯(HCB)是典型的持久性有機污染物，具有致畸、致癌、致突變性質，嚴重地威脅著人類身體健康。盡管二者在環(huán)境中化學性質很穩(wěn)定，但仍然可以降解生成其他代謝產物。六氯苯可以通過細胞色素 P450途徑代謝生成具有活性的四氯苯醌(TCBQ)和四氯氫醌(TCHQ)，五氯酚則可以通過鞘氨醇桿菌代謝為四氯苯醌，然后進一步還原成四氯氫醌。在這些代謝過程中會產生大量ROS，破壞生物體內的氧化還原平衡，導致毒性效應的發(fā)生，如遺傳毒性、肝

2、毒性、免疫毒性、神經毒性等。
　　隨著人口老齡化現(xiàn)象地加重，許多神經退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森等疾病的患病率也逐漸增高。引起這些疾病的因素很多，包括環(huán)境、基因及老齡化等相關內源性因素，但基本可以概括為由于氧化應激的產生導致的神經炎癥形成。近幾年來，關于六氯苯和五氯酚的神經毒性研究已經很多，但是關于四氯苯醌的神經毒性，特別是炎癥病理機制的研究資料卻很少見。探討四氯苯醌誘導PC12細胞炎癥反應的機制，可以為有關神經系統(tǒng)疾病的預防

3、和治療提供新思路。因此，本文選用PC12細胞作為研究對象，設想它引起的炎癥毒性與ROS的產生有關，做了以下兩部分實驗。
　?。ㄒ唬┧穆缺锦せ領KK/IκB/NF-κB信號通路的機制研究
　　本實驗旨在比較六氯苯、五氯酚、四氯氫醌和四氯苯醌四種化合物對 PC12細胞的細胞毒性、ROS產量、促炎癥因子表達的作用，然后進一步探討四氯苯醌激活NF-κB信號通路的機制。首先利用CCK-8實驗，比較了四種化合物在不同濃度、不同時間條件

4、下的細胞毒性，結果發(fā)現(xiàn)四種化合物的細胞毒性呈現(xiàn)時間和濃度依賴性增加，并且與ROS的形成密切相關，其中TCBQ和TCHQ毒性強于PCP、HCB。從DCFH-DA探針檢測ROS水平及免疫印跡檢測促炎癥因子表達的實驗結果中發(fā)現(xiàn)TCBQ和TCHQ對ROS和促炎癥因子的誘導作用強于HCB和PCP。接著用免疫印跡和 RT-qPCR實驗手段從濃度梯度上考察了四氯苯醌誘導IKK/IκB/NF-κB信號通路相關炎癥蛋白的表達情況及促炎癥因子的mRNA水平

5、，及采用NF-κB特異性抑制劑PDTC考察了TCBQ誘導NF-κB核轉錄活性。實驗結果顯示TCBQ可以誘導NF-κB信號通路中相關蛋白表達，還可以提高促炎癥因子的mRNA水平，PDTC則明顯抑制TCBQ誘導的NF-κB核轉錄及其與目的基因結合的活性?？寡趸瘎㎞AC、維生素E和姜黃素可以清除TCBQ作用細胞產生的ROS，還可以部分抑制IKK/IκB/NF-κB信號通路中相關蛋白表達，這說明ROS在IKK/IκB/NF-κB信號通路的活化中

6、扮演著重要角色。
　?。ǘ┩屎谒剞卓顾穆缺锦せ頗MGB1/TLR4/MyD88信號通路的機制研究
　　四氯苯醌的促炎、促氧化作用在第一部分實驗中已經得到證實；關于HMGB1/TLR4/MyD88在炎癥研究中的重要性，很多文獻都有介紹；褪黑素是松果體分泌的一種激素，為強大的內源性抗氧化劑，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用。基于以上三點，本實驗把TCBQ、褪黑素、HMGB1/TLR4/MyD88三者聯(lián)系起來，對它們的相互作用機

7、制進行了探討。
　　首先利用CCK-8實驗篩選了褪黑素減緩 TCBQ細胞毒性的最適給藥濃度，最終我們選用200μM褪黑素預處理細胞1h，再給予25μM TCBQ培養(yǎng)細胞6 h進行后面的實驗研究。用免疫印跡實驗、免疫共沉淀及RT-qPCR實驗考察了TCBQ對TLR4、MD2、CD14、MyD88的影響，還考察了褪黑素在這個過程中的作用，結果發(fā)現(xiàn) TCBQ可以誘導TLR4、MD2、CD14、MyD88的蛋白表達，TLR4和MyD88的

8、mRNA水平上升，及促進TLR4與其適配器MD2、CD14、MyD88的結合，然而褪黑素抑制了TLR4和其適配器的表達，還抑制了它們的相互結合作用。接著也考察了褪黑素對TCBQ誘導的MAPKs活性的影響，及對下游炎癥因子的表達情況，結果顯示褪黑素可以逆轉TCBQ對MAPKs活性的誘導作用。用TLR4 siRNA、MyD88 siRNA轉染PC12細胞觀察蛋白表達情況，用TLR4敲除的小鼠實驗觀察小鼠腦部切片的HE染色、免疫組化和免疫熒光

9、圖，發(fā)現(xiàn)TCBQ在TLR4和MyD88基因缺陷的情況下，炎癥損傷明顯降低，這強調了TLR4信號途徑在TCBQ誘導的神經炎癥中的重要作用。
　　接著我們探討了TCBQ是如何激活TLR4信號通路的。通過免疫熒光、免疫印跡及免疫共沉淀實驗，證明TCBQ可以使HMGB1在細胞核內發(fā)生乙酰化和磷酸化修飾，隨后進入細胞質，釋放到培養(yǎng)基里。用免疫印跡、免疫熒光、RT-qPCR和免疫共沉淀實驗考察了TCBQ在HMGB1和其受體中的作用，結果發(fā)現(xiàn)T

10、CBQ可以誘導HMGB1及其受體（TLR2、TLR4、TLR9、RAGE）的表達，及促進HMGB1與其受體的結合，在這些受體中，HMGB1與 TLR4的作用最強。接著通過蔗糖密度梯度分離實驗，將裂解液分成12個片段，再利用免疫印跡實驗證實TCBQ、HMGB1和LPS可以誘導TLR4/MD2向脂筏區(qū)域募集，褪黑素作為抗氧化劑跟NAC、脂筏抑制劑(β-環(huán)糊精和制霉菌素)顯示相同的結果，這說明了ROS參與了TCBQ誘導TLR4向脂筏轉運的過程