RIP1-3依賴的程序性壞死在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分RIP1/3依賴的程序性壞死促使OVX大鼠骨細(xì)胞過度死亡
　　目的：
　　檢測程序性壞死關(guān)鍵信號分子RIP1、RIP3在OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥模型中骨組織的表達(dá)情況，并比較不同時期發(fā)生程序性壞死骨細(xì)胞數(shù)量的差異，以證實程序性壞死參與了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1.將健康成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為OVX（卵巢切除術(shù)，48只）和Sham（假手術(shù)，48只）兩組，分別行卵巢切除術(shù)或假手術(shù)

2、造模。并且將OVX和sham組大鼠分別按不同時間點隨機(jī)分為0W、4W、8W、12W組（每組12只）。
　　2.應(yīng)用DXA測定股骨近端的骨密度，Micro-CT掃描Ward's三角骨組織微結(jié)構(gòu)變化。
　　3.應(yīng)用熒光定量 PCR、western blot及免疫組化法測定 TNF-α、RIP1、RIP3的表達(dá)情況，應(yīng)用激光共聚焦觀察RIP1和RIP3蛋白共表達(dá)情況，應(yīng)用TUNEL+ cleaved caspase-3熒光染色及透

3、射電鏡辨別骨細(xì)胞的死亡方式。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠行 OVX術(shù)后8W，股骨近端骨密度明顯降低(P＜0.05)， Ward's三角骨組織Tb.Sp（trabecular separation，骨小梁分離度）明顯增高，而BV/TV（bone volume fraction，骨體積分?jǐn)?shù)）、Tb.N（trabecular number，骨小梁數(shù)量）明顯降低(P＜0.05)，到術(shù)后12w，股骨近端骨密度、BV/TV、Tb.N進(jìn)一步

4、降低，同時Tb.Th（trabecular thickness，骨小梁分厚度）也明顯降低(P＜0.01)，而Ward's三角骨組織Tb.Sp進(jìn)一步增高。
　　2.在OVX術(shù)后8W，電鏡下發(fā)現(xiàn)具有典型壞死形態(tài)特征的骨細(xì)胞；激光共聚焦顯示RIP1和RIP3蛋白于骨細(xì)胞胞漿呈明顯共表達(dá)；但在術(shù)后0W,4W，12W均未發(fā)現(xiàn)發(fā)生明顯壞死樣變化的骨細(xì)胞和明顯RIP1和RIP3蛋白的共表達(dá)。從術(shù)后4W開始，OVX大鼠TUNEL和cleaved

5、caspase-3陽性骨細(xì)胞百分率較 sham組明顯增多(P＜0.05)；在術(shù)后8W，TUNEL和cleaved caspase-3陽性骨細(xì)胞百分率進(jìn)一步增多(P＜0.01)。在術(shù)后12 W，增高的TUNEL和cleaved caspase-3陽性骨細(xì)胞百分率下降。
　　3.免疫組化結(jié)果顯示:TNF-α、RIP1、RIP3蛋白在骨細(xì)胞胞漿中均有表達(dá)，TNF-α陽性骨細(xì)胞百分率在OVX術(shù)后4W表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，RIP1、

6、RIP3陽性骨細(xì)胞百分率在OVX術(shù)后4W表達(dá)增加不明顯，TNF-α、RIP1、RIP3陽性骨細(xì)胞百分率在OVX術(shù)后8W較0W均顯著增多(P＜0.01)，但術(shù)后12 W，增高的陽性骨細(xì)胞百分率下降。
　　4.熒光定量PCR和western blot結(jié)果顯示：骨組織TNF-α、RIP1、RIP3蛋白表達(dá)在OVX術(shù)后4W較0W組表達(dá)有所增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異。OVX術(shù)后8W TNF-α(P＜0.01)、RIP1(P＜0.05)、RIP3(

7、P＜0.05)蛋白表達(dá)較0W組明顯增強(qiáng)。但術(shù)后12 W，增高的TNF-α、RIP1、RIP3蛋白表達(dá)下降；骨組織TNF-α、RIP1 mRNA表達(dá)在OVX術(shù)后4W較0W組表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，而RIP3 mRNA表達(dá)增加不明顯；術(shù)后8W TNF-α(P＜0.01)、RIP1(P＜0.01)、RIP3(P＜0.05) mRNA表達(dá)較0W組明顯增強(qiáng)，但術(shù)后12 W，增高的TNF-α、RIP1、RIP3 mRNA表達(dá)下降。
　　

8、結(jié)論：
　　1.在 OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程中，骨細(xì)胞發(fā)生了程序性壞死，且OVX術(shù)后8W是骨細(xì)胞程序性壞死的高峰期。
　　2. TNF-α可能是骨細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的觸發(fā)因素。
　　第二部分Necrostatin-1通過抑制OVX大鼠骨細(xì)胞發(fā)生RIP1/3依賴的程序性壞死延緩骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展
　　目的：
　　應(yīng)用程序性壞死抑制劑Necrostatin-1(Nec-1)干預(yù)OVX大鼠，探討Nec-1能否

9、通過抑制骨細(xì)胞發(fā)生程序性壞死而延緩骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。
　　方法：
　　1.將SD大鼠隨機(jī)分為OVX（卵巢切除術(shù)，48只）和control（12只）兩組，分別行卵巢切除術(shù)和假手術(shù)。并將OVX組大鼠再分為4組：OVX+vehicle組、OVX+Nec-1組、OVX+Z-VAD組、OVX+E2組。在OVX術(shù)后4W，分別給予OVX+Nec-1組、OVX+Z-VAD組、OVX+E2組大鼠腹腔注射Nec-1、Z-VAD、E2，每日一次共

10、4W。
　　2.應(yīng)用TUNEL+ cleaved caspase-3熒光染色觀察并比較不同干預(yù)對骨細(xì)胞發(fā)生凋亡或程序性壞死的影響；電鏡觀察不同干預(yù)對骨細(xì)胞形態(tài)變化的影響；Micro-CT觀察不同干預(yù)對骨組織微結(jié)構(gòu)變化的影響；ELISA檢測不同干預(yù)對血清PINP及CTX變化的影響；應(yīng)用熒光定量PCR、western blot測定不同干預(yù)對骨組織cleaved caspase-3、RIP1、RIP3、MLKL表達(dá)情況的影響，并通過激光

11、共聚焦觀察不同干預(yù)對RIP1-RIP3共表達(dá)陽性骨細(xì)胞百分率變化的影響。
　　結(jié)果：
　　1. Nec-1可以明顯抑制骨細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生，從而降低TUNEL陽性骨細(xì)胞的百分率(P＜0.01)。
　　2.應(yīng)用Nec-1處理OVX大鼠后，RIP1 mRNA和蛋白水平的增高得以控制，MLKL的蛋白表達(dá)減少(P＜0.01)。而應(yīng)用Z-VAD干預(yù)后， caspase-3 mRNA和蛋白水平明顯下降(P＜0.01)。激光共聚焦

12、顯微鏡可觀察到：Nec-1可以降低 RIP1-RIP3蛋白共表達(dá)陽性骨細(xì)胞百分率(P＜0.01)。
　　3.應(yīng)用Nec-1或Z-VAD干預(yù)后，OVX大鼠的骨吸收減少而骨形成增加，組織微結(jié)構(gòu)退變減輕(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1. Nec-1可以有效抑制OVX大鼠骨細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，從而延緩骨組織的退變。
　　2.骨細(xì)胞發(fā)生的程序性壞死和凋亡兩種死亡方式均參與了 OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥發(fā)病過程。
　　

13、第三部分TNF-α誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞發(fā)生RIP1/3依賴的程序性壞死及其機(jī)制研究
　　目的：
　　探討TNF-α能否誘導(dǎo)小鼠長骨骨樣細(xì)胞( MLO-Y4)發(fā)生程序性壞死,旨在從細(xì)胞水平闡明TNF-α可能是誘導(dǎo)骨細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的重要原因并探討其機(jī)制。
　　方法：
　　首先用TNF-α處理MLO-Y4細(xì)胞，分別在12、24、36、48小時收集標(biāo)本，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測MLO-Y4凋亡和壞死率，找出TNF-α誘導(dǎo)

14、細(xì)胞死亡高峰的最佳時間點。然后用Nec-1、Z-VAD、RIP3-siRNA干擾片段預(yù)處理MLO-Y4細(xì)胞后再用TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測MLO-Y4凋亡和壞死率，透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，用western blot、激光共聚焦檢測 RIP1、RIP3、cleaved caspase-3、MLKL、Drp1蛋白表達(dá)。應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞活性氧水平。
　　結(jié)果：
　　TNF-α誘導(dǎo) MLO-Y4細(xì)胞24小時凋

15、亡或壞死率達(dá)到高峰。與TNF-α組相比，Z-VAD、Nec-1、RIP3-siRNA均能降低MLO-Y4的凋亡或壞死率(P<0.01)。在TNF-α組可見大量壞死樣結(jié)構(gòu)的MLO-Y4，在 Z-VAD組仍可見到壞死樣結(jié)構(gòu)的 MLO-Y4，而在 Nec-1和RIP3-siRNA組未見發(fā)生明顯發(fā)生壞死的MLO-Y4。與TNF-α組比較， Nec-1可顯著降低RIP1-RIP3蛋白共表達(dá)陽性細(xì)胞百分率(P<0.01)，而Z-VAD對其無影響。W

16、estern blot結(jié)果顯示：與TNF-α組比較，Nec-1可明顯抑制RIP1、MLKL、Drp1蛋白表達(dá)，而Z-VAD對RIP1、RIP3、MLKL蛋白表達(dá)無影響，RIP3-siRNA可有效降低RIP3、MLKL、Drp1蛋白表達(dá)(P<0.01)。與對照相比，TNF-α組的 ROS水平明顯增高（P<0.01）。與TNF-α組相比，Nec-1、Z-VAD及RIP3-siRNA均能有效抑制ROS水平（P<0.01）。
　　結(jié)論：<