白藜蘆醇在脂多糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(neurodegenerativediseases，NDD)是一組嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量和致殘的慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)組織退行性變性疾病，隨人口老齡化的不斷進(jìn)展患病率日益增高，本組疾病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，推測(cè)與細(xì)胞興奮毒性、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等機(jī)制有關(guān)，因此目前相關(guān)預(yù)防和治療此類疾病的藥物均不能達(dá)到較理想的效果。它包括阿爾茨海默病(alzheimerdisease，AD)，帕金森氏病(Parkinsondiseas

2、e，PD)，亨廷頓病(Huntington'sdisease，HD)，肌萎縮側(cè)索硬化?。╝myotrophiclateralsclerosis，ALS）等疾病。其病理特點(diǎn)為具有特定功能的神經(jīng)核團(tuán)發(fā)生萎縮和神經(jīng)元丟失。這種神經(jīng)元的丟失通常伴有星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)膠質(zhì)過多癥以及特定的神經(jīng)病理標(biāo)記，如帕金森病的路易小體(lewybody)。臨床上，對(duì)于這類疾病尚無有效控制病程進(jìn)展的措施，患者最終將喪失生活能力甚至死亡。目前，隨著社會(huì)的進(jìn)步、

3、老年人口的比例和數(shù)量不斷增加，這類疾病已經(jīng)成為影響我國(guó)人口健康水平和生活質(zhì)量的重大社會(huì)問題。近二十年的研究發(fā)現(xiàn)沉默信息調(diào)控因子類(silentinformationregulator，Sirtuins)與此類疾病密切相關(guān)，它的激活和抑制可能參與NDD發(fā)生發(fā)展過程的調(diào)節(jié)，此發(fā)現(xiàn)給今后預(yù)防和治療此類疾病指引了新的方向。
　　 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)被廣泛認(rèn)為是刺激大腦產(chǎn)生炎癥的炎癥原，它是細(xì)菌內(nèi)毒素，

4、是革蘭氏陰性菌外膜上的成分，通過協(xié)調(diào)炎癥調(diào)節(jié)者的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)先天性免疫，可以刺激炎癥因子和氧自由基的產(chǎn)生，繼而促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生和進(jìn)展。PC12細(xì)胞是大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，國(guó)際上廣泛作為神經(jīng)元模型研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病。細(xì)胞凋亡是程序性的細(xì)胞死亡方式，它是神經(jīng)退行性疾病病理生理有關(guān)的主要的信號(hào)路徑之一。目前的研究表明LPS誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡進(jìn)程中，NF-KB、COX-2、Bax、BCL-2、Caspase-3、Hsp70等參與凋亡過程

5、，但LPS促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未完全闡明。PC12細(xì)胞株源于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，常規(guī)條件下培養(yǎng)，該細(xì)胞株性質(zhì)與嗜鉻瘤細(xì)胞相似，可作為一種兒茶酚胺細(xì)胞，因此，PC12細(xì)胞同時(shí)具有神經(jīng)分泌細(xì)胞和神經(jīng)元的性質(zhì)，已被廣泛用于神經(jīng)細(xì)胞死亡方式及神經(jīng)毒理方面的研究，PC12細(xì)胞含有的酶類、膜受體及合成的遞質(zhì)等方面很接近于中腦多巴胺神經(jīng)元，因此，我們選PC12細(xì)胞作為多巴胺神經(jīng)元的細(xì)胞模型。雖然對(duì)PC12細(xì)胞的研究結(jié)果無法完全代替黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元

6、，但可以間接地為基礎(chǔ)研究或臨床治療提供新的思路。
　　 組蛋白去乙酰化酶類(Histonedeacetylases，HDACs)根據(jù)它們與酵母菌轉(zhuǎn)錄抑制物的同源性被劃分為三類（Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類）。Ⅰ類和Ⅱ類的催化核心是明顯類似的，與酵母菌去乙?；窻pd3p和Hdalp同源。而HDACsⅢ與Ⅰ類和Ⅱ類沒有序列相似性，它和酵母菌轉(zhuǎn)錄抑制劑——沉默信息調(diào)節(jié)因子(Silentinformationregulator2，Sir2)同源，

7、我們把這類沉默信息調(diào)節(jié)因子稱為Sirtuins。Sirtuins廣泛存在于原核生物和真核生物中。這類蛋白家族有高度的序列相似性，它們根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析法被劃分為五類（Ⅰ-Ⅳ和U）。人類基因編碼七個(gè)Sirtuins(Sirt1-Sirt7)，類別上跨越Ⅰ-Ⅳ類。Sirtuins是NAD+依賴的組蛋白去乙?；涪螅℉istonedeacetylases，HDACⅢ）它們是NAD+依賴的，通過去乙?；拇呋钚园l(fā)揮作用。
　　 哺乳動(dòng)物

8、Sir2基因家族(Sirtuins)包括7個(gè)成員:SIRT1-7。7個(gè)Sirtuins蛋白定居在不同的亞細(xì)胞位置發(fā)揮不同的功能。SIRT1是一種重要的核蛋白，它可以使H4K16和大量的非組蛋白靶點(diǎn)例如P53，Ku70，PPARγ，PGC-1α，NF-κB，HIF-2α，XPA和若干FOXO亞型去乙?；?。因此SIRT1是被包括在多種多樣重要的細(xì)胞進(jìn)程中，包括增殖，DNA修復(fù)機(jī)制和凋亡，并且被認(rèn)為在癌癥和葡萄糖的體內(nèi)平衡中也發(fā)揮重要的作用。

9、此外，上調(diào)SIRT1可能調(diào)節(jié)能量限制對(duì)生命進(jìn)程的影響在低等生物的研究上。SIRT2定位在細(xì)胞質(zhì)作為一種微管去乙?；傅撬泊嬖谟诩?xì)胞核內(nèi)并且和組蛋白相互作用。盡管SIRT2作為一種潛在的腫瘤抑制劑，最近的研究表明同時(shí)抑制SIRT1和SIRT2對(duì)P53介導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡方面是必不可少的。SIRT3、SIRT4、SIRT5是線粒體蛋白，它們和大量的調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的進(jìn)程相關(guān)。例如SIRT3使線粒體合酶、乙酰輔酶a合酶2和谷氨酸鹽去乙酰化使其激活

10、，谷氨酸鹽通過檸檬酸途徑產(chǎn)生ATP。SIRT4，至今鑒定的沒有去乙?；富钚缘奈镔|(zhì)，它對(duì)抗SIRT3對(duì)谷氨酸ADP核糖基化的影響。SIRT4基因敲除的大鼠在葡萄糖刺激時(shí)顯著提高胰島素的水平，而過表達(dá)SIRT4的大鼠胰島素分泌則顯著減少。最近發(fā)現(xiàn)在肝和肌肉細(xì)胞依賴SIRT4的脂肪酸氧化方面也支持抑制SIRT4可能對(duì)治療糖尿病有利。通過使氨甲酰磷酸合成酶(1)去乙?；疭IRT5控制尿素循環(huán)最初的步驟并且出去毒性氨。SIRT6是一種核蛋白，它

11、使調(diào)節(jié)末端著絲粒的染色質(zhì)的H3K9去乙?；?。敲除SIRT6導(dǎo)致染色質(zhì)缺乏進(jìn)而導(dǎo)致過早老化的癥狀和甘油三酯合成增多和脂肪肝形成等代謝紊亂。SIRT6也通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)機(jī)制有助于基因組的穩(wěn)定。SIRT7和核內(nèi)RNA聚合酶I相關(guān)所以被認(rèn)為是參與轉(zhuǎn)錄，它還與細(xì)胞活力相關(guān)。SIRT7可能通過確保組織穩(wěn)態(tài)阻止心臟老化。目前Sirtuins與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的關(guān)系正日益受到人們的關(guān)注。
　　 Sirtuins的激活劑包括白藜蘆醇(resv

12、eratrol，Res)、漆樹黃酮(fistein)、紫鉚因(butein)等，主要通過激活組蛋白去乙?；傅幕钚詠硌娱L(zhǎng)細(xì)胞的壽命。Sirtuins的抑制劑包括煙酰胺、sirtinol、splitomicin等。白藜蘆醇的存在形式有4種:順式白藜蘆醇、反式白藜蘆醇、順式白藜蘆醇苷和反式白藜蘆醇苷。后兩種形式在腸道中可被糖苷酶分解釋放出白藜蘆醇，發(fā)揮其藥理作用。其中，反式異構(gòu)體生理活性強(qiáng)于順式異構(gòu)體，單體的活性大于糖苷。在紫外光照射下反式

13、白藜蘆醇能夠轉(zhuǎn)化為順式異構(gòu)體。白藜蘆醇廣泛存在于種子植物中，目前至少在12科31屬72種植物中被發(fā)現(xiàn)。富含白藜蘆醇的植物主要有葡萄、花生及中藥虎杖等，尤其在新鮮的葡萄皮中含量最高，并以反式占主導(dǎo)地位。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，法國(guó)人的冠心病等心血管疾病的發(fā)病率和死亡率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于英美等國(guó)，即“法國(guó)怪圈”(Franchporadox)。其原因可能是飲用適量的紅葡萄酒作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其中起主要作用的是紅葡萄酒中所含成分白藜蘆醇作用的結(jié)果。Res通

14、過N端和SIRT1相連，提高它的活性來發(fā)揮作用。因?yàn)镽ES與細(xì)胞壽命和存活的相關(guān)性，所以RES為“長(zhǎng)生不老”藥物受到廣泛關(guān)注。本文研究RES在神經(jīng)元細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)揮的作用，為以上假說提供相關(guān)證據(jù)。
　　 為了觀察SIRT1是否參與LPS誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡過程及其RES在這一過程中發(fā)揮的作用，本文將進(jìn)行以下兩部分實(shí)驗(yàn)。
　　 第一部分:SIRT1在脂多糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡中的作用
　　 研究目的:
　

15、　 探討SIRT1在脂多糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡中的作用。
　　 研究方法:
　　 第一組實(shí)驗(yàn)（確定LPS的損傷濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)）
　　 ①正常組:PC12細(xì)胞正常培養(yǎng)，加入生理鹽水;
　　 ②實(shí)驗(yàn)組:PC12細(xì)胞分別與200μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、1250gμ/ml濃度LPS作用24h。
　　 MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞的存活率。
　　 第二

16、組實(shí)驗(yàn)（觀察SIRT1和細(xì)胞凋亡的關(guān)系）
　　 ①正常組:PC12細(xì)胞正常培養(yǎng)，加入生理鹽水;
　　 ②實(shí)驗(yàn)組:PC12細(xì)胞分別與濃度為1000μg/ml的LPS作用1/2h、2h、18h、24h、48h。
　　 Hoechst染色、流式細(xì)胞技術(shù)觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡情況;Westernblotting技術(shù)定量不用時(shí)間點(diǎn)SIRT1的表達(dá)。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、MTT結(jié)果顯示不同濃度LPS刺

17、激PC12細(xì)胞都可導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降，200μg/ml與250μg/ml濃度對(duì)存活率的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。然后隨著濃度增加細(xì)胞存活率逐漸下降，1000μg/ml時(shí)存活率(0.6267±0.02)％，1250μg/ml時(shí)達(dá)到最低(0.4533±0.05)％。根據(jù)以上結(jié)果本實(shí)驗(yàn)選擇1000μg/ml濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　 2、Hoechst染色結(jié)果提示自1/2h開始觀察到PC12細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，表現(xiàn)為核固縮、核碎裂，

18、18h開始凋亡小體增多，24h達(dá)到高峰，48小時(shí)后又有所下降;
　　 3、流式細(xì)胞儀測(cè)量結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組PC12細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨時(shí)間延長(zhǎng)凋亡率逐漸增加，24h時(shí)達(dá)到高峰，48h后又有所下降，這與Hoechst染色法觀察到的PC12細(xì)胞凋亡結(jié)果相吻合;
　　 4、Westernblotting法定量測(cè)量各時(shí)間點(diǎn)SIRT1的表達(dá)情況，對(duì)照組表達(dá)量(1.84±0.04)，自1/2h開始S

19、IRT1蛋白表達(dá)有所減低(1.17±0.09)，24h時(shí)表達(dá)最低(0.62±0.03)，48h組表達(dá)量有所回升（0.77±0.02），各組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):
　　 結(jié)論:
　　 本部分實(shí)驗(yàn)中觀察到LPS可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，抑制SIRT1的表達(dá)，細(xì)胞凋亡程度與SIRT1的表達(dá)量相關(guān)，1000μg/ml濃度的LPS作用24h凋亡率最高，SIRT1在此時(shí)表達(dá)最低。
　　 第二部分:白藜

20、蘆醇在脂多糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡中的作用
　　 研究目的:
　　 白藜蘆醇在脂多糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡中的作用。
　　 研究方法:
　　 實(shí)驗(yàn)分為6組，第1組加入生理鹽水，2組LPS濃度為1mg/ml，3組LPS濃度為1mg/ml，RES濃度為5μM，4組LPS濃度為1mg/ml，RES濃度為10μM，5組LPS濃度為1mg/ml，RES濃度為5μM，6組加入DMSO濃度與3、4、5組溶解Res所需D

21、MSO濃度相同。
　　 1、流式細(xì)胞技術(shù)觀察6組細(xì)胞凋亡情況;
　　 2、Westernbotting技術(shù)定量SIRT1的表達(dá);
　　 研究結(jié)果:
　　 1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果為2與3組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1與6組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、Westernblotting法定量測(cè)量各時(shí)間點(diǎn)SIRT1的表達(dá)情況，2與3差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1與6差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組均有