tBHQ作用下Nrf2信號系統(tǒng)對氟化鈉誘導(dǎo)PC12細胞凋亡的保護作用.pdf

1、氟是地球上含量最豐富的第13位元素，在自然界分布很廣，是人體必需微量的元素。自然界中的氟分布極不均勻，不同地域存在很大差異，我國是地方性氟中毒的高分布國家，現(xiàn)有病縣1296個，占全國總縣數(shù)的46.8％，人口大約為1億。氟的氧化能力極強，可以直接或間接地與幾乎所有其它元素化合生成相應(yīng)的氟化物。因此，氟對于生態(tài)環(huán)境以及人類健康的影響已成為人們關(guān)注的衛(wèi)生學(xué)問題。
　　 有報道表明氟具有神經(jīng)毒性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是人體最重要的系統(tǒng)之一，而且

2、對外源性化合物的毒性作用比較敏感，因此氟對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害作用尤其值得重視。高氟地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查顯示，長期攝入氟使兒童智商和記憶力下降，從而危及高氟地區(qū)兒童的基本素質(zhì)，可能造成深遠影響。動物實驗也證明氟影響學(xué)習(xí)記憶，其機制可能與氧化應(yīng)激相關(guān)。
　　 PC12細胞株源于大鼠嗜鉻細胞瘤，具有神經(jīng)分泌細胞和神經(jīng)元的性質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細胞死亡方式及神經(jīng)毒理方面的研究。目前，氟的神經(jīng)毒性已被證實，但作用機制尚未完全闡明。本研究以類

3、神經(jīng)元模型PC12細胞株為研究對象，觀察不同劑量氟化鈉處理組PC12細胞的存活率，細胞內(nèi)活性氧含量、Nrf2蛋白、γ-GCS、HO-1、Nrf2mRNA的表達水平、細胞內(nèi)谷胱甘肽含量和細胞凋亡率的變化，以及給予叔丁基對苯二酚誘導(dǎo)后上述指標(biāo)的改變情況，以探討氟化鈉對神經(jīng)元凋亡的影響、可能機制及Nrf2信號通路對細胞的保護作用，從而為深入開展氟的神經(jīng)毒性研究提供新的實驗證據(jù)。
　　 實驗分組
　　 NaF用無血清的1640配

4、制，使終濃度分別為20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml，對照組使用無血清1640。
　　 研究方法:
　　 1、MTT法測定PC12細胞增殖能力
　　 2、DCFH-DA熒光探針法測定細胞內(nèi)ROS含量
　　 3、Western-Blot法測定細胞內(nèi)Nrf2蛋白含量
　　 4、RT-PCR法測定細胞內(nèi)γ-GCS、HO-1、Nrf2 mRNA表達
　　 5、DTNB

5、法測定細胞內(nèi)GSH含量6、流式細胞儀法測定細胞凋亡率
　　 結(jié)果:
　　 1、PC12細胞增殖能力檢測
　　 氟化鈉對PC12細胞有一定毒性，隨著染毒劑量的升高而增加，除對照組與20ug/ml組、20ug/ml與40ug/ml組間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)外，其他各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 叔丁基對苯二酚5umol/L、10umol/L、20umol/L組對細胞無毒性作用，4

6、0umol/L組對細胞產(chǎn)生毒性，且與其他組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 經(jīng)叔丁基對苯二酚誘導(dǎo)后的細胞能抵抗氟化鈉的毒性作用，與同劑量單純?nèi)痉M相比40ug/ml和80ug/ml組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2、PC12細胞內(nèi)活性氧含量改變
　　 單純?nèi)痉M細胞內(nèi)ROS含量隨氟化鈉染毒劑量的升高而增多，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。經(jīng)叔丁基對苯二酚誘導(dǎo)后細胞內(nèi)ROS含量比同

7、劑量單純?nèi)痉M降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3、PC12細胞內(nèi)谷胱甘肽含量改變
　　 單純?nèi)痉M細胞內(nèi)GSH含量隨氟化鈉染毒劑量的升高而減少，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。經(jīng)叔丁基對苯二酚誘導(dǎo)后細胞內(nèi)GSH含量比同劑量單純?nèi)痉M升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4、PC12細胞內(nèi)γ-GCS、HO-1、Nrf2 mRNA表達改變
　　 單純?nèi)痉M細胞內(nèi)GCSh mR

8、NA表達量隨氟化鈉染毒劑量的升高而降低，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。經(jīng)叔丁基對苯二酚誘導(dǎo)后20ug/ml組細胞內(nèi)GCSh mRNA表達量低于同劑量單純?nèi)痉M且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);40ug/ml和80ug/ml組細胞內(nèi)GCSh mRNA表達量高于同劑量單純?nèi)痉M且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 單純?nèi)痉M細胞內(nèi)HO-1 mRNA表達量隨氟化鈉染毒劑量的升高而降低，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P＜0.01

9、)。經(jīng)叔丁基對苯二酚誘導(dǎo)后40ug/ml和80ug/ml組細胞內(nèi)HO-1 mRNA表達量高于同劑量單純?nèi)痉M且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 不同劑量氟化鈉染毒組GCS1和Nrf2 mRNA表達量間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 5、PC12細胞內(nèi)Nrf2蛋白表達改變
　　 單純?nèi)痉M細胞內(nèi)Nrf2蛋白表達量隨氟化鈉染毒劑量的升高而降低，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。經(jīng)叔丁基對苯二酚誘導(dǎo)

10、后40ug/ml和80ug/ml組細胞內(nèi)Nrf2蛋白表達量高于同劑量單純?nèi)痉M且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 6、PC12細胞凋亡率改變
　　 單純?nèi)痉M細胞凋亡率隨氟化鈉染毒劑量的升高而增多，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。經(jīng)叔丁基對苯二酚誘導(dǎo)后細胞內(nèi)凋亡率比同劑量單純?nèi)痉M降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、氟化鈉能夠降低PC12細胞的存活率，增加細胞