tBHQ作用下Nrf2信號(hào)系統(tǒng)對(duì)氟化鈉誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用.pdf

1、氟是地球上含量最豐富的第13位元素，在自然界分布很廣，是人體必需微量的元素。自然界中的氟分布極不均勻，不同地域存在很大差異，我國(guó)是地方性氟中毒的高分布國(guó)家，現(xiàn)有病縣1296個(gè)，占全國(guó)總縣數(shù)的46.8％，人口大約為1億。氟的氧化能力極強(qiáng)，可以直接或間接地與幾乎所有其它元素化合生成相應(yīng)的氟化物。因此，氟對(duì)于生態(tài)環(huán)境以及人類健康的影響已成為人們關(guān)注的衛(wèi)生學(xué)問(wèn)題。
　　 有報(bào)道表明氟具有神經(jīng)毒性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是人體最重要的系統(tǒng)之一，而且

2、對(duì)外源性化合物的毒性作用比較敏感，因此氟對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害作用尤其值得重視。高氟地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查顯示，長(zhǎng)期攝入氟使兒童智商和記憶力下降，從而危及高氟地區(qū)兒童的基本素質(zhì)，可能造成深遠(yuǎn)影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明氟影響學(xué)習(xí)記憶，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激相關(guān)。
　　 PC12細(xì)胞株源于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，具有神經(jīng)分泌細(xì)胞和神經(jīng)元的性質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞死亡方式及神經(jīng)毒理方面的研究。目前，氟的神經(jīng)毒性已被證實(shí)，但作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究以類

3、神經(jīng)元模型PC12細(xì)胞株為研究對(duì)象，觀察不同劑量氟化鈉處理組PC12細(xì)胞的存活率，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量、Nrf2蛋白、γ-GCS、HO-1、Nrf2mRNA的表達(dá)水平、細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量和細(xì)胞凋亡率的變化，以及給予叔丁基對(duì)苯二酚誘導(dǎo)后上述指標(biāo)的改變情況，以探討氟化鈉對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響、可能機(jī)制及Nrf2信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，從而為深入開(kāi)展氟的神經(jīng)毒性研究提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)分組
　　 NaF用無(wú)血清的1640配

4、制，使終濃度分別為20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml，對(duì)照組使用無(wú)血清1640。
　　 研究方法:
　　 1、MTT法測(cè)定PC12細(xì)胞增殖能力
　　 2、DCFH-DA熒光探針?lè)y(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量
　　 3、Western-Blot法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白含量
　　 4、RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)γ-GCS、HO-1、Nrf2 mRNA表達(dá)
　　 5、DTNB

5、法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH含量6、流式細(xì)胞儀法測(cè)定細(xì)胞凋亡率
　　 結(jié)果:
　　 1、PC12細(xì)胞增殖能力檢測(cè)
　　 氟化鈉對(duì)PC12細(xì)胞有一定毒性，隨著染毒劑量的升高而增加，除對(duì)照組與20ug/ml組、20ug/ml與40ug/ml組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)外，其他各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 叔丁基對(duì)苯二酚5umol/L、10umol/L、20umol/L組對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，4

6、0umol/L組對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，且與其他組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 經(jīng)叔丁基對(duì)苯二酚誘導(dǎo)后的細(xì)胞能抵抗氟化鈉的毒性作用，與同劑量單純?nèi)痉M相比40ug/ml和80ug/ml組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2、PC12細(xì)胞內(nèi)活性氧含量改變
　　 單純?nèi)痉M細(xì)胞內(nèi)ROS含量隨氟化鈉染毒劑量的升高而增多，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。經(jīng)叔丁基對(duì)苯二酚誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)ROS含量比同

7、劑量單純?nèi)痉M降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3、PC12細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量改變
　　 單純?nèi)痉M細(xì)胞內(nèi)GSH含量隨氟化鈉染毒劑量的升高而減少，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。經(jīng)叔丁基對(duì)苯二酚誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)GSH含量比同劑量單純?nèi)痉M升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4、PC12細(xì)胞內(nèi)γ-GCS、HO-1、Nrf2 mRNA表達(dá)改變
　　 單純?nèi)痉M細(xì)胞內(nèi)GCSh mR

8、NA表達(dá)量隨氟化鈉染毒劑量的升高而降低，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。經(jīng)叔丁基對(duì)苯二酚誘導(dǎo)后20ug/ml組細(xì)胞內(nèi)GCSh mRNA表達(dá)量低于同劑量單純?nèi)痉M且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);40ug/ml和80ug/ml組細(xì)胞內(nèi)GCSh mRNA表達(dá)量高于同劑量單純?nèi)痉M且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 單純?nèi)痉M細(xì)胞內(nèi)HO-1 mRNA表達(dá)量隨氟化鈉染毒劑量的升高而降低，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P＜0.01

9、)。經(jīng)叔丁基對(duì)苯二酚誘導(dǎo)后40ug/ml和80ug/ml組細(xì)胞內(nèi)HO-1 mRNA表達(dá)量高于同劑量單純?nèi)痉M且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 不同劑量氟化鈉染毒組GCS1和Nrf2 mRNA表達(dá)量間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 5、PC12細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)改變
　　 單純?nèi)痉M細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)量隨氟化鈉染毒劑量的升高而降低，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。經(jīng)叔丁基對(duì)苯二酚誘導(dǎo)

10、后40ug/ml和80ug/ml組細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)量高于同劑量單純?nèi)痉M且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 6、PC12細(xì)胞凋亡率改變
　　 單純?nèi)痉M細(xì)胞凋亡率隨氟化鈉染毒劑量的升高而增多，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。經(jīng)叔丁基對(duì)苯二酚誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)凋亡率比同劑量單純?nèi)痉M降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、氟化鈉能夠降低PC12細(xì)胞的存活率，增加細(xì)胞