NF-κB在1-溴丙烷致大鼠中樞神經(jīng)毒性中的作用.pdf

1、目的:
　　1-溴丙烷（1-bromopropane，1-BP），又名正溴丙烷，溴代正丙烷等，是一種無(wú)色透明的有機(jī)溶劑，可通過(guò)正丙醇與氫溴酸或溴化鈉反應(yīng)得到。1-BP具有易揮發(fā)、不易燃、對(duì)臭氧層破壞小以及在空氣中的半衰期短（17.5天到24天）等特點(diǎn)，因此從20世紀(jì)90年代1-BP逐漸成為消耗臭氧層物質(zhì)(ozone depletingsubstance，ODS)如氟利昂類(lèi)的替代劑。1-BP也被廣泛應(yīng)用于藥物、殺蟲(chóng)劑、芳香劑和其它化

2、學(xué)試劑制造的中間體;還作為脂肪、樹(shù)脂、石蠟的溶劑和一些精密電子儀器的清洗劑。中國(guó)是1-BP主要生產(chǎn)國(guó)，2008年的年產(chǎn)量就達(dá)到了20，000噸，其中約五分之二用于出口。隨著1-BP需求量的不斷增加，1-BP接觸和使用的人群也在不斷擴(kuò)大。
　　流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究都觀察到1-BP能夠引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervous system，CNS)和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)異常

3、。有研究證實(shí)CNS的異常早于PNS。從1999年美國(guó)報(bào)道了第一例1-BP職業(yè)中毒患者之后，各國(guó)1-BP中毒病例也相繼報(bào)道，我國(guó)也已發(fā)現(xiàn)1-BP中毒患者。目前1-BP神經(jīng)毒性的確切機(jī)制不清，臨床上也沒(méi)有治療1-BP神經(jīng)中毒的特效藥物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到1-BP能夠明顯減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大腦內(nèi)還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)的含量，產(chǎn)生氧化應(yīng)激。體外實(shí)驗(yàn)觀察到1-BP能夠激活巨噬細(xì)胞內(nèi)的核因子-κB(nucler factor kap

4、paB，NF-κB)，但1-BP是否能夠激活CNS的NF-κB，以及NF-κB的激活是否與1-BP的神經(jīng)毒性相關(guān)尚未報(bào)道。因此在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們首先觀察了1-BP染毒后大鼠大腦內(nèi)GSH的變化，并觀察了大腦中氧化應(yīng)激感受器NF-κB和Nrf-2的激活情況，及NF-κB下游炎性因子的應(yīng)答變化和Nrf-2下游Ⅱ相酶γ-谷氨酸半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase，GCL）和谷胱甘肽還原酶(glutathione

5、reductase，GR)的變化。在1-BP染毒同時(shí)給予NF-κB抑制劑-吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)，觀察動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)改善、大腦中GSH的變化以及NF-κB和Nrf-2的激活情況，推斷NF-κB在1-BP致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性中的作用，探討1-BP致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制，以期為1-BP的預(yù)防和臨床治療提供可以借鑒的依據(jù)。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處

6、理:60只雄性Wistar大鼠(220-240g)適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后隨機(jī)分成4組，即對(duì)照組、1-BP染毒組、PDTC+1-BP組以及PDTC對(duì)照組，每組15只。1-BP染毒組和PDTC+1-BP組每天經(jīng)口給予800mg/kg·bw1-BP，對(duì)照組和PDTC組每天灌胃等體積玉米油，灌胃體積均為2ml/kg·bw。PDTC組和PDTC+1-BP組每天經(jīng)腹腔注射劑量為100mg/kg·bw的PDTC;對(duì)照組和1-BP組每天注射同等體積的生理鹽水

7、，注射體積為5ml/kg·bw。連續(xù)給予13天，其中從第8天到第13天每組隨機(jī)取10只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后動(dòng)物斷頭處死，在冰上迅速剝離大腦皮層，液氮速凍后置于-80℃冰箱待后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。每組剩余5只大鼠進(jìn)行心臟灌注，制備冰凍切片用于后續(xù)研究。
　　2.Morris水迷宮試驗(yàn):從第8天開(kāi)始每組隨機(jī)取10只大鼠進(jìn)行連續(xù)6天的Morris水迷宮試驗(yàn)（第一天為訓(xùn)練，數(shù)據(jù)不記錄），記錄40只大鼠的學(xué)習(xí)能力包括游泳

8、總路程、逃避潛伏期，以及空間記憶指標(biāo)-穿越平臺(tái)次數(shù)。
　　3.免疫組化檢測(cè):制備各組動(dòng)物大腦的冰凍切片，然后采用免疫組化檢測(cè)各組大鼠大腦前額葉皮質(zhì)的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目變化。
　　4.氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè):采用試劑盒分別檢測(cè)大腦前額葉皮質(zhì)GSH、GSSG含量，計(jì)算GSH/GSSG的比值，并檢測(cè)γ-GCL和GR的活性;檢測(cè)大腦內(nèi)一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量和一氧化氮合成酶(nitri

9、c oxide synthase，NOS)的活性變化。
　　5.Western blot檢測(cè):檢測(cè)大腦前額葉皮質(zhì)中脂質(zhì)過(guò)氧化物4-羥基-2-壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal，4-HNE）、γ-GCL、NF-E2相關(guān)因子2(transcription factorNF-E2-related factor-2，Nrf-2)、NF-κB、磷酸化的NF-κB的表達(dá)。
　　6.炎性因子檢測(cè):采用實(shí)時(shí)定量PCR（quant

10、itative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)各組大鼠大腦皮層前額葉皮質(zhì)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β（interleukine-1β，IL-1β）的變化。
　　結(jié)果:
　　1.1-BP和PDTC對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響:與對(duì)照組相比，1-BP染毒組大鼠游泳總路程延長(zhǎng)（P＜0.05）、逃避潛伏期時(shí)間增多(P＜0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少（P＜0

11、.05）。與1-BP組相比，PDTC+1-BP組大鼠游泳總路程明顯縮短(P＜0.05)、逃避潛伏期時(shí)間減少(P＜0.05)，且穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多(P＜0.05)，提示1-BP能夠損傷大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，抑制NF-κB激活可以有效的改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力障礙。Morris水迷宮試驗(yàn)顯示各組大鼠的游泳平均速度無(wú)明顯差異(P＜0.05)，排除了混雜因素的干擾。
　　2.1-BP和PDTC對(duì)大腦GSH的含量的影響:與對(duì)照組相比，1

12、-BP染毒組大鼠大腦前額葉皮質(zhì)中還原型GSH含量明顯減少（P＜0.05），氧化型GSSG含量增多（P＜0.05），GSH/GSSG的比值降低(P＜0.05)。與1-BP組相比，PDTC+1-BP組大鼠大腦前額葉皮質(zhì)GSH含量增加（P＜0.05），氧化型GSSG含量減少（P＜0.05），GSH/GSSG的比值升高(P＜0.05)，提示1-BP能夠?qū)е聶C(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，消耗大腦內(nèi)的GSH，阻斷NF-κB激活也有效改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大腦的氧化還原狀

13、態(tài)。
　　3.1-BP和PDTC對(duì)大腦Nrf-2激活的影響:與對(duì)照組相比，1-BP組大腦前額葉皮質(zhì)胞漿內(nèi)Nrf-2含量增加并且核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)(P＜0.05)，下游Ⅱ相酶GR、γ-GCL的蛋白含量增加，但酶活性明顯降低(P＜0.05)。PDTC+1-BP組與對(duì)照組相比，胞漿內(nèi)Nrf-2含量和核轉(zhuǎn)位也明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，下游Ⅱ相酶GR、γ-GCL的蛋白含量增高，其中酶活性與1-BP組相比明顯增高(P＜0.05)。提示1-BP能夠激活

14、大腦內(nèi)Nrf-2通路，使Ⅱ相酶表達(dá)增加，啟動(dòng)機(jī)體的防御機(jī)制。但1-BP暴露后，與蛋白質(zhì)水平含量增加相關(guān)，GR、γ-GCL的活性卻明顯降低。抑制NF-κB激活可使GR、γ-GCL的活性得到恢復(fù)。
　　4.1-BP和PDTC對(duì)大腦氧化修飾蛋白的影響:與對(duì)照組相比，1-BP組大腦前額葉皮質(zhì)內(nèi)氧化修飾蛋白4-HNE和MDA的含量增高（P＜0.05）;PDTC+1-BP組與1-BP相比，4-HNE和MDA的含量降低（P＜0.05）。提示1-

15、BP升高大腦內(nèi)氧化修飾蛋白的含量，抑制NF-κB激活可以有效改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)的氧化失衡。
　　5.1-BP和PDTC對(duì)大腦內(nèi)NF-κB激活的影響:與對(duì)照組相比，1-BP組大腦前額葉皮質(zhì)胞漿和胞核內(nèi)NF-κB蛋白含量均增高(P＜0.05)，而且NF-κB的核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)（P＜0.05）;炎性因子TNF-α、IL-1β的含量也顯著升高(P＜0.05)，NO含量增多（P＜0.05）、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible NOS，iNOS

16、)活性升高（P＜0.05）。PDTC+1-BP組與1-BP組相比，大腦胞漿內(nèi)NF-κB和胞核內(nèi)蛋白含量均明顯減少（P＜0.05），NF-κB核轉(zhuǎn)位減弱（P＜0.05），炎性因子TNF-α、IL-1β的含量減少(P＜0.05)，NO含量減少(P＜0.05)、iNOS活性降低(P＜0.05)。提示1-BP能夠激活NF-κB，并導(dǎo)致其下游炎性因子分泌增多和活性氮(reactivenitrogen species，RNS)增多;阻斷NF-κB激

17、活可有效抑制炎性因子和RNS的產(chǎn)生和釋放。
　　6.1-BP和PDTC對(duì)大腦膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的影響:與對(duì)照組相比，1-BP暴露后，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯，1-BP組大腦前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)目也明顯減少(P＜0.05)。PDTC+1-BP組與1-BP相比，神經(jīng)元數(shù)目增加（P＜0.05），小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化被明顯抑制。提示1-BP能夠?qū)е麓竽X內(nèi)炎性反應(yīng)，并導(dǎo)致神經(jīng)元損傷;阻斷NF-κB激活、抑制腦內(nèi)炎性反應(yīng)，可有效逆

18、轉(zhuǎn)1-BP對(duì)大腦的損傷。
　　結(jié)論:
　　1.1-BP可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活、神經(jīng)元丟失，大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　2.1-BP可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB激活，阻斷NF-κB活化可有效逆轉(zhuǎn)1-BP導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，1-BP導(dǎo)致的腦內(nèi)炎性反應(yīng)與1-BP的神經(jīng)毒性密切相關(guān)。
　　3.1-BP暴露可激活腦內(nèi)的Nrf-2通路，Nrf-2激活可能是大腦對(duì)1-BP神經(jīng)毒性的代償反