1-溴丙烷中毒性周圍神經(jīng)病大鼠神經(jīng)組織氧化修飾蛋白的含量變化.pdf

1、研究目的:
　　 為保護(hù)大氣臭氧層，具有氟利昂類易揮發(fā)、不易燃等特點(diǎn)的1-BP(1-bromopropane，1-BP)逐漸成為氟利昂類的替代品，因其在大氣中半衰期短，不會(huì)對(duì)臭氧層造成破壞，是全球目前廣泛應(yīng)用的有機(jī)溶劑和清洗劑。常用作脂肪、石蠟、樹脂等的溶劑，制造藥品、殺蟲劑、香精、調(diào)味料等的中間體，精密電子儀器的清洗劑，脫垢劑以及噴霧粘合劑中的溶劑等。長(zhǎng)期無防護(hù)接觸1-BP可導(dǎo)致1-BP中毒性神經(jīng)病。隨著《蒙特利爾議定書》的執(zhí)

2、行，國(guó)內(nèi)外對(duì)1-BP需求量大幅上升，1-BP的職業(yè)接觸人群和使用人群也逐年增加。1-BP急性毒性較低，加上目前無1-BP的職業(yè)接觸限值(occupational exposure limits，OEL)，1-BP潛在的職業(yè)危害較大。
　　 1-BP致周圍神經(jīng)毒性的機(jī)制尚不清楚。實(shí)驗(yàn)研究顯示1-BP染毒后導(dǎo)致動(dòng)物肝臟、大腦等器官中還原性谷胱甘肽（Glutathione，GSH）耗竭、氧化應(yīng)激。我們先前的研究也顯示1-BP引起氧化應(yīng)

3、激，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物對(duì)大腦中蛋白質(zhì)的氧化修飾與1-BP對(duì)認(rèn)知功能的損傷相關(guān)。尤其是近年來一系列的研究提示人類一些神經(jīng)退行性病變的發(fā)生與氧化應(yīng)激相關(guān)。因此，我們采用1-BP經(jīng)口慢性染毒，建立1-溴丙烷周圍神經(jīng)病的動(dòng)物模型，通過觀察周圍神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)的變化，判定1-BP對(duì)周圍神經(jīng)的損傷;采用相對(duì)特異、敏感的抗體檢測(cè)了1-BP染毒大鼠神經(jīng)組織中脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物4-羥基-2-壬烯醛(4-hydroxiynonenal，4-HNE)蛋白質(zhì)加合物、丙

4、二醛(malondialdehyde，MDA)蛋白質(zhì)加合物、4-羥基-2-己烯醛(4-hydroxy-2-hexenal，4-HHE)蛋白質(zhì)加合物和丙烯醛(arcolein)蛋白質(zhì)加合物的含量變化，觀察1-BP神經(jīng)組織蛋白的氧化修飾情況;并通過體外實(shí)驗(yàn)觀察了1-BP對(duì)4-HNE蛋白加合物形成的影響及劑量-效應(yīng)關(guān)系，以期為解釋周圍神經(jīng)的損傷機(jī)制提供線索。
　　 研究方法：
　　 1、40只雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為低、

5、中、高劑量組和對(duì)照組，每組10只;將1-BP溶于玉米油中，分別經(jīng)口給予200、400、800 mg/kg的1-BP，對(duì)照組給予等體積玉米油，灌胃體積均為0.2 mL/100g.bw，每日1次，每周5天，連續(xù)16周，建立1-溴丙烷經(jīng)口慢性染毒致周圍神經(jīng)病模型，并定期檢測(cè)步態(tài)、后肢抓力、后肢撐力、鼠尾痛覺等神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)，觀察1-BP對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。
　　 2、斷頭處死大鼠，迅速分離大腦、脊髓和坐骨神經(jīng)組織，制備組織勻漿，15

6、000g、4℃離心30min。利用Western blotting方法測(cè)定大鼠大腦、脊髓、坐骨神經(jīng)組織中的4-HNE、MDA、4-HHE、arcolein蛋白加合物相對(duì)含量的變化，觀察脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物對(duì)大鼠神經(jīng)組織蛋白的氧化修飾水平。
　　 3、1-BP對(duì)神經(jīng)組織4-HNE氧化修飾蛋白影響的體外實(shí)驗(yàn)，將4-HNE、1-BP與空白組大鼠的大腦、脊髓、坐骨神經(jīng)組織蛋白共同孵育，觀察1-BP對(duì)4-HNE蛋白加合物形成的影響及劑量-效應(yīng)關(guān)

7、系。
　　 結(jié)果:
　　 1、1-BP對(duì)大鼠周圍神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果
　　 高劑量組染毒8-16周、中劑量組染毒14、15、16周和低劑量組染毒15、16周大鼠的步態(tài)評(píng)分均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。與對(duì)照組比較，高劑量組染毒9、12、14周大鼠后肢抓力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);染毒16周時(shí)，動(dòng)物后肢癱瘓。染毒16周時(shí)，中、低劑量組大鼠后肢抓力

8、分別為對(duì)照組的72.56％和91.22％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。染毒12、14、16周時(shí)，高劑量組大鼠后肢撐力指數(shù)明顯高于對(duì)照組;染毒14、16周時(shí)，中劑量組大鼠后肢撐力指數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。染毒8周高、中劑量組和染毒16周高、中、低劑量組血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活力均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 2、1-BP染毒對(duì)大腦、

9、脊髓、神經(jīng)組織中4-HNE、MDA、4-HHE、arcolein蛋白加合物水平的影響
　　 1-BP染毒對(duì)4-HNE蛋白加合物表達(dá)水平的影響:與對(duì)照組相比，在大腦組織中，高劑量組大鼠4-HNE蛋白加合物增加了27.57％(P＜0.01)，低、中劑量組分別增加了11.82％和20.94％，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。脊髓組織中，低、中、高劑量組分別為對(duì)照組的5.37％、16.82％、17.82％，與對(duì)照組相比均無

10、顯著性差異。坐骨神經(jīng)組織中，低劑量組僅比對(duì)照組增加了17.83％，中、高劑量組確分別升高了64.64％(P＜0.01)、117.59％(P＜0.01)。
　　 1-BP染毒對(duì)MDA蛋白加合物表達(dá)水平的影響:與對(duì)照組相比，在大腦組織中，高劑量組增加了179.38％(P＜0.01)，低、中劑量分別增加了24.08％和30.14％，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脊髓組織中，低、中、高劑量組分別為對(duì)照組的4.02％、33.48％、53.

11、34％，與對(duì)照組相比增加不顯著。坐骨神經(jīng)組織中，低劑量組與對(duì)照組相差無幾，而中、高劑量組MDA蛋白加合物表達(dá)水平明顯升高，分別升高了46.03％(P＜0.01)、70.13％(P＜0.01)。
　　 1-BP染毒對(duì)4-HHE蛋白質(zhì)加合物的水平的影響:與對(duì)照組相比，在大腦組織中，低劑量組與照組比較略有下降，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;中劑量組與對(duì)照組相比增加不明顯;而高劑量組增加了16.40％(P＜0.01)。脊髓組織中，低、中、高劑量組分

12、別為對(duì)照組的54.78％、44.21％、45.52％，但無顯著差異。坐骨神經(jīng)組織中，低劑量組僅比對(duì)照組升高37.26％，中、高劑量組4-HHE蛋白質(zhì)加合物明顯升高，分別升高了67.58％(P＜0.01)、59.34％(P＜0.01)。
　　 1-BP染毒對(duì)Arcolein蛋白質(zhì)加合物水平的影響:與對(duì)照組相比，在大腦組織中，低、中、高劑量組分別增加了7.97％(P＜0.05)、22.09％(P＜0.01)、29.99％(P＜0.0

13、1)。脊髓組織中，低、中、高劑量組分別為對(duì)照組的46.25％(P＜0.01)、57.17％（P＜0.01）、77.28％（P＜0.01）。但坐骨神經(jīng)組織中，低、中、高劑量組分別降低38.65％(P＜0.01)、35.07％(P＜0.01)、49.05％(P＜0.01)。
　　 3、1-BP對(duì)4-HNE氧化修飾神經(jīng)組織蛋白影響的體外實(shí)驗(yàn)
　　 在體外實(shí)驗(yàn)體系中，正常大鼠的大腦、脊髓、坐骨神經(jīng)組織中，幾乎檢測(cè)不到4-HNE蛋

14、白質(zhì)加合物，將50uM的1-BP與正常大鼠的大腦、脊髓、坐骨神經(jīng)組織共同孵育后，實(shí)驗(yàn)顯示反應(yīng)體系中有少量的4-HNE蛋白加合物形成。將神經(jīng)組織中加入4-HNE共同孵育，反應(yīng)體系中可檢測(cè)到大腦、脊髓和坐骨神經(jīng)蛋白均能被4-HNE氧化修成形成4-HNE蛋白質(zhì)加合物。將不同濃度的1-BP與神經(jīng)組織和4-HNE共同孵育，結(jié)果顯示1-BP能夠增強(qiáng)4-HNE對(duì)神經(jīng)組織蛋白的修飾作用，與單純加入4-HNE相比，4-HNE+25uM1-BP、4-HNE

15、+50uM1-BP、4-HNE+100uM1-BP反應(yīng)體系中，大腦組織中，4-HNE蛋白質(zhì)加合物分別增加了18.87％、51.01％(P＜0.01)、58.08％(P＜0.01)。脊髓組織中，4-HNE+25uM1-BP組、4-HNE+50uM1-BP組、4-HNE+100uM1-BP組增加了83.25％(P＜0.01)、116.11％(P＜0.01)、211.73％(P＜0.01)。在坐骨神經(jīng)組織中4-HNE+25uM1-BP組、4-

16、HNE+50uM1-BP組、4-HNE+100uM1-BP組中分別增加了35.32％、72.21％(P＜0.01)、128.76％(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、神經(jīng)系統(tǒng)是1-BP毒作用的敏感靶器官，1-BP暴露可導(dǎo)致大鼠中毒性周圍神經(jīng)病。
　　 2、1-BP染毒導(dǎo)致神經(jīng)組織中脂質(zhì)過氧化修飾蛋白表達(dá)增加，
　　 3、1-BP能夠增強(qiáng)4-HNE對(duì)大鼠神經(jīng)組織蛋白質(zhì)的氧化修飾，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。