紅葉芥花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、紅葉根用芥(Brassica juncea var.napiformis)，以下簡(jiǎn)稱紅葉芥，是蕓薹屬芥菜種中的一類蔬菜作物，其肉質(zhì)根主要做腌漬用，國(guó)內(nèi)栽培面積廣，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。葉色獨(dú)特的紅葉芥是根用芥菜中較為獨(dú)特的品種，其葉片從子葉展開一直呈現(xiàn)出由花青素積累而形成的紫紅色。近年來，隨著對(duì)合成色素安全性的研究，很多對(duì)人體具有安全隱患的合成色素已不再使用，因此，花青素作為一種安全的天然色素備受關(guān)注。類黃酮類化合物是植物次生代謝的重要產(chǎn)

2、物，大多數(shù)植物葉色和花色的呈現(xiàn)都是因?yàn)檫@類化合物的生成而產(chǎn)生。花青素是植物體內(nèi)主要的類黃酮類水溶性色素，在模式植物中其生物合成途徑的研究已經(jīng)較為詳細(xì)，在模式植物中該途徑大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因和一部分調(diào)控基因均已分離。但紅葉芥中花青素的分子調(diào)控機(jī)理研究還沒有報(bào)道，因此對(duì)紅葉芥花青素生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的克隆與表達(dá)對(duì)于闡明紅葉芥葉色形成機(jī)理、利用基因工程進(jìn)行新品種選育和天然色素的開發(fā)利用具有重要的意義。
　　 本研究以紅葉芥葉片為材料，根

3、據(jù)花青素生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因保守序列設(shè)計(jì)特異引物和簡(jiǎn)并引物，克隆得到PAL、CHS、CHI、DFR、F3'H和ANS等六個(gè)結(jié)構(gòu)基因片段，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)了在環(huán)境脅迫下紅葉芥葉片花青素合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況以及不同葉色根用芥菜中花青素合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。主要研究結(jié)果如下：1、花青素生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因的克隆
　　 根據(jù)已經(jīng)發(fā)布的芥菜花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因保守序列設(shè)計(jì)了特異引物或簡(jiǎn)并引物，從紅葉芥葉片c

4、DNA中克隆得到了兩個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA：CHI基因(GenbankAccesion：GU230157，包含一個(gè)759bp的開放閱讀框)和DFR基因(開放閱讀框長(zhǎng)度為1206bp)；利用特異引物克隆得到了PAL(Genbank Accesion：GQ505065)、CHS(Genbank Accesion：GU230158)、F3'H和ANS(Genbank Accesion：GU230160)基因的部分cDNA保守序列。序列分析表明六

5、個(gè)結(jié)構(gòu)基因與其他植物的花青素生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因具有較高的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明6個(gè)結(jié)構(gòu)基因的系統(tǒng)進(jìn)化符合植物分類學(xué)的分類。2、環(huán)境脅迫下CHI、DFR和ANS基因的表達(dá)分析
　　 利用熒光定量RT-PCR方法分析了CHI、DFR和ANS基因在環(huán)境脅迫下(模擬干旱、低溫和光照脅迫)紅葉芥葉片中的表達(dá)情況。結(jié)果表明：DFR和ANS基因在經(jīng)過環(huán)境脅迫處理后表達(dá)量顯著增加，而CHI基因經(jīng)過處理后表達(dá)量保持在一個(gè)較低的水平。CHI基因

6、雖然表達(dá)量極低，但在不同脅迫下都有微量表達(dá)。其中低溫和光照脅迫下，DFR和ANS基因在處理12小時(shí)后表達(dá)量開始上升,CHI基因表達(dá)量始終較低并無明顯變化；低溫脅迫下DFR和ANS基因在處理48小時(shí)后達(dá)到最大值，光照脅迫下在處理后96小時(shí)達(dá)到最大值；模擬干旱脅迫下，DFR和ANS基因表達(dá)量均高于CHI基因，但三者表達(dá)量都較低。3、根用芥菜CHS、F3'H、DFR和ANS基因的表達(dá)分析
　　 利用熒光定量RT-PCR方法分析了CHS