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文檔簡(jiǎn)介
1、苦蕎(Fagopyrum tataricum)為蓼科蕎麥屬雙子葉禾谷類(lèi)作物??嗍w作為一種藥食兩用作物,其最重要的生物活性成分為黃酮,以蘆丁為代表的黃酮醇是其主要儲(chǔ)存形式。然而,在遭受冷和紫外等脅迫時(shí),另外一類(lèi)黃酮花青素的合成則對(duì)苦蕎逆境生理的穩(wěn)定具有重要作用。植物花青素的生物合成在轉(zhuǎn)錄水平主要受到R2R3-MYB、bHLH和WD40等轉(zhuǎn)錄因子蛋白單獨(dú)或者形成三元復(fù)合物的調(diào)控,其中轉(zhuǎn)錄因子WD40更多的是提供平臺(tái)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子MYB和bHL
2、H的互作。本研究以“西蕎2號(hào)”苦蕎為材料,克隆花青素調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FtWD40的cDNA序列,并鑒定其轉(zhuǎn)錄激活活性;分析花青素和FtWD40基因表達(dá)在苦蕎中的組織特異性及其相關(guān)性,也分析了在苦蕎逆境脅迫條件下二者變化趨勢(shì)間的相關(guān)性;進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)鑒定FtWD40過(guò)表達(dá)對(duì)煙草花青素合成的影響。本研究可望明確苦蕎轉(zhuǎn)錄因子FtWD40對(duì)在花青素合成途徑中的主要效應(yīng)基因,加深對(duì)苦蕎逆境脅迫中花青素合成調(diào)控分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。主要取得以下研究
3、結(jié)果:
1、采用同源克隆法和RACE技術(shù),獲得1條苦蕎WD40基因,命名為FtWD40。FtWD40 ORF框?yàn)?035 bp,編碼344個(gè)氨基酸殘基,相對(duì)分子質(zhì)量65.9 KDa;聚類(lèi)分析結(jié)果顯示,F(xiàn)tWD40和參與花青素代謝調(diào)控的AtTTG1和VvWD等聚為一簇。對(duì)花期苦蕎根、莖、葉和花中的花青素含量,以及FtWD40基因表達(dá)的測(cè)定表明,花青素含量和FtWD40的基因表達(dá)量都具有相同的組織特異,均為花>根>葉>莖,二者相關(guān)
4、性系數(shù)為r=0.875(P<0.05)。在冷脅迫和UV-B脅迫下,芽期苦蕎花青素含量與FtWD40基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)分別為r=0.785(P<0.05)和r=0.891(P<0.05)。以上結(jié)果表明,F(xiàn)tWD40可能參與了苦蕎花青素合成的調(diào)控。
2、構(gòu)建pBridge-FtWD40真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化酵母AH109,經(jīng)SD/-Trp/-His雙缺培養(yǎng)篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)酵母單雜交系統(tǒng)中的β-半乳糖苷酶活性濾紙分析,結(jié)果表明F
5、tWD40蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
3、構(gòu)建pECMBIA1301-Ft WD40植物表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草愈傷組織,進(jìn)而對(duì)篩選獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草中花青素含量及花青素合成途徑中的NtPAL、NtCHS、NtANS、NtDFR、NtFLS和NtF3'H等基因的表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定分析。FtWD40轉(zhuǎn)基因煙草T-1、T-2和T-3株系中的花青素含量分別提高為對(duì)照平均的3.45倍、2.81倍和3.24倍(P<0.01)。同時(shí)
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