石蒜花色苷合成相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、石蒜屬植物是廣泛分布于我國(guó)的一種優(yōu)良的球根類(lèi)觀賞植物，現(xiàn)已應(yīng)用于鮮切花、地被綠化、園林景觀配置等方面。本研究以石蒜花瓣為材料，克隆了花色素苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，并對(duì)其時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行分析，同時(shí)構(gòu)建了其中3個(gè)基因的植物表達(dá)載體，以期為今后研究石蒜花色形成的分子機(jī)理以及利用基因工程技術(shù)選育花色新品種奠定基礎(chǔ);主要研究成果如下：
　　 ⑴采用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)的方法，獲得了花色素苷生物合成途徑中LrCHI、LrFLS、L

2、rF3H、LrDFR和LrANS5個(gè)結(jié)構(gòu)基因的cDNA全長(zhǎng)序列，分別為948 bp、1360 bp、1293 bp、1338 bp和1292 bp，分別編碼236、333、365、364和355個(gè)氨基酸。利用NCBI的Blastn和Blastp工具進(jìn)行比對(duì)分析顯示，5個(gè)結(jié)構(gòu)基因與其它已知植物的相關(guān)基因均具有較高的同源性。運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)5個(gè)結(jié)構(gòu)基因的分子量、等電點(diǎn)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行了分析，同時(shí)在多序

3、列比對(duì)的基礎(chǔ)上構(gòu)建了其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，5個(gè)基因的系統(tǒng)進(jìn)化基本符合植物分類(lèi)學(xué)分類(lèi)，且具有較明顯的種屬特性。
　　 ⑵利用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)對(duì)石蒜花色素苷生物合成途徑中的關(guān)鍵基因LrCHI、LrFLS、LrF3H、LrDFR和LrANS在不同花發(fā)育時(shí)期及不同器官中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，LrCHI和LrDFR在花發(fā)育的前幾個(gè)時(shí)期表達(dá)量較高;LrF3H基因和LrANS基因的表達(dá)量都是隨著花的開(kāi)放逐漸增

4、加，而后隨著花的萎蔫表達(dá)量又下降;只有LrFLS基因在凋謝期花瓣中的表達(dá)量最高，而在其它時(shí)期的表達(dá)量相對(duì)較低。在不同器官中的表達(dá)分析表明LrCHI和LrFLS表達(dá)特征相似，即在葉、花葶及花瓣中表達(dá)量較高，而在根和鱗莖中表達(dá)量相對(duì)較低;LrF3H、LrDFR和LrANS基因都是在根、鱗莖和葉中表達(dá)量較低，而在花葶和花瓣中表達(dá)量相對(duì)較高。
　　 ⑶為進(jìn)一步研究LrF3H、LrDFR和LrANS基因的功能，分別將3個(gè)基因連接到含有35