山葡萄花色苷生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因克隆與表達(dá).pdf

1、山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)是我國(guó)重要的野生果樹(shù)資源?；ㄉ帐巧狡咸压麑?shí)中主要的多酚類(lèi)次生代謝產(chǎn)物,與山葡萄的抗病性、色澤、風(fēng)味等密切相關(guān)?；ㄉ詹粌H影響植物源食品的感官和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,還具有多種醫(yī)藥方面的生理活性。本文進(jìn)行了山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮eDNA文庫(kù)的構(gòu)建,對(duì)山葡萄花色苷生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行了克隆和序列分析,對(duì)山葡萄果實(shí)不同成熟期,不同組織與器官中花色苷合成的相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行了初步研究。主要研究結(jié)果如下:

2、r>　　 通過(guò)三種提取方法提取山葡萄果皮和葉片中的總RNA,其中改良CTAB法能分離出高質(zhì)量的RNA,可用于下一步的分子生物學(xué)研究。以轉(zhuǎn)色期(50％著色)山葡萄果皮為材料,提取總RNA合成cDNA,連接到質(zhì)粒載體pDNR-LIB上,采用電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α中,成功構(gòu)建了山葡萄果皮cDNA文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)量鑒定表明,原始文庫(kù)滴度為1.12×106pfu·mL-1,擴(kuò)增后的文庫(kù)滴度為2.82×109 pfu·mL-1,重組率接近1

3、00％,插入片段大小范圍在0.5～2kb之間,平均約為0.80 kb,表明應(yīng)用SMARTTM技術(shù)已成功構(gòu)建了山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫(kù)。
　　 山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫(kù)測(cè)序獲得974條有效EST序列。GenBank登錄號(hào):GW666520～GW667493。974條EST拼接后代表了710個(gè)Unigenes。BLAST注釋結(jié)果表明,具有已知或推測(cè)功能基因270個(gè),未知功能基因258個(gè),未比對(duì)上的基因182個(gè)(可能是新基因)

4、。根據(jù)BLASTX注釋與GO分類(lèi),199條EST序列具有細(xì)胞組件功能,313條EST序列在分子功能上得到注釋,341條EST序列在生物學(xué)途徑上得到注釋。
　　 采用RT-PCR、SMARTTM RACE技術(shù)從山葡萄成熟期果皮中克隆到了類(lèi)黃酮-3'-羥化酶(VAmF3'H)、類(lèi)黃酮-3,5'-羥化酶(VAmF3'5'H)、黃烷酮醇4-還原酶(VAmDFR)、無(wú)色花色素雙加氧酶(VAmLDOX)、類(lèi)黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(VAm

5、3GT),O-甲基轉(zhuǎn)移酶(VAmOMT),谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(VAmGST4)和類(lèi)黃酮5-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(VAmOGT)等8個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)序列。GenBank登錄號(hào)為:FJ645766、FJ645767、FJ645768、FJ645769、FJl69463、GU237132、FJ645770和GU237133。利用生物信息學(xué)分析,推測(cè)8個(gè)基因分別編碼509、508、337、355、456、235、213和448個(gè)氨基酸的多肽,分子

6、量為56.14、56.70、37.50、40.19、50.19、26.35、24.24和49.84 kDa。與其它物種相關(guān)基因的氨基酸序列進(jìn)行了多重比較,各基因與歐亞種葡萄(Vitis vinfera L.)相關(guān)基因的相似性均超過(guò)90％。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了這8個(gè)基因與其它物種相應(yīng)基因的分子進(jìn)化樹(shù),分析了與其它物種相關(guān)基因的親緣關(guān)系。各基因信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明,8個(gè)基因都不具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu),對(duì)各基因分別進(jìn)行了疏水性分析,初步預(yù)測(cè)了其二級(jí)結(jié)構(gòu)。<

7、br>　　 對(duì)山葡萄幼葉、成熟葉、莖、果肉和果皮中花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)進(jìn)行了初步研究。半定量RT-PCR分析結(jié)果表明,VAmF3'H和VAmF3'5'H在花后各個(gè)時(shí)期的果皮中均有表達(dá),轉(zhuǎn)色期上調(diào)表達(dá);VAmDFR、VAmLDOX和VAmOGTG在花后各個(gè)時(shí)期的果皮中均有表達(dá),各個(gè)時(shí)期的表達(dá)強(qiáng)度差異不明顯;VAm3GT和VAmGST4在果實(shí)轉(zhuǎn)色期前基本不表達(dá),轉(zhuǎn)色期為上調(diào)表達(dá);VAmOMT在花后兩周有少量表達(dá),隨后表達(dá)量下降,轉(zhuǎn)

8、色期開(kāi)始上調(diào)表達(dá)。VAmF3'H、VAmF3'5'H,VAmDFR、VAmLDOX和VAmOGT在各個(gè)組織與器官中均有表達(dá),但VAmF3'5'H在成熟葉中的表達(dá)量很少;VAm3GT、VAmOMT和VAmGST4在葉片中都不表達(dá),在莖、果肉、果皮中都有表達(dá),VAmOMT在果肉中表達(dá)豐度低。Northern雜交結(jié)果表明,VAm3GT在果實(shí)轉(zhuǎn)色期前基本不表達(dá),轉(zhuǎn)色期上調(diào)表達(dá);VAmOGT在果實(shí)成熟過(guò)程中均有表達(dá)。
　　 用DNA重組技