芍藥種子中α-亞麻酸生物合成相關(guān)基因的克隆與表達(dá).pdf

1、植物油脂中的脂肪酸與人體健康具有密切聯(lián)系，根據(jù)其飽和度可分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸;多不飽和脂肪酸又可分為n-3和n-6等系列。其中，α-亞麻酸(ALA)為植物源性n-3脂肪酸，是人體必需脂肪酸，在調(diào)節(jié)血脂、降低血壓和血糖，預(yù)防癌癥等，抗炎癥，增強(qiáng)免疫力，保護(hù)視力和提高記憶力等方面具有重要作用。因此，挖掘富含ALA的芍藥種質(zhì)資源，明晰調(diào)控ALA生物合成的關(guān)鍵基因以及其合成與調(diào)控的分子機(jī)制，可以為今后選育優(yōu)良品種以及通

2、過(guò)遺傳工程提高芍藥籽油ALA含量奠定理論基礎(chǔ)。為此，本論文利用GC-MS技術(shù)測(cè)定了9個(gè)芍藥品種脂肪酸成分及其相對(duì)含量，明確了不同發(fā)育時(shí)期脂肪酸相對(duì)含量的變化，篩選出ALA含量差異顯著的兩個(gè)品種‘PL1’和‘PL2’;運(yùn)用RACE技術(shù)克隆了7個(gè)與種子中ALA合成相關(guān)基因，分析了2個(gè)芍藥代表品種‘PL1’和‘PL2’形成過(guò)程中ALA含量變化及其相關(guān)合成基因表達(dá)的差異，主要結(jié)果如下:(1)利用GC-MS技術(shù)分析了9個(gè)芍藥品種的脂肪酸成分，鑒定

3、出了15種脂肪酸成分:月桂酸(C12∶0)、豆蔻酸(C14∶0)、十五烷酸(C15∶0)、棕櫚酸(PA，C16∶0)、棕櫚一烯酸(C16∶1)、十七烷酸(C17∶0)、十七碳一烯酸(C17∶1)、硬脂酸(SA，C18∶0)、油酸(OA，C18∶1)、亞油酸(LA，C18∶2)、ALA(C18∶3)、10-十九烯酸(C19∶1)、花生酸(C20∶0)、花生一烯酸(C20∶1)、花生二烯酸(C20∶2)。種子成熟時(shí)期，籽油中總不飽和脂肪酸占

4、到總脂肪酸的90％以上，其中相對(duì)含量超過(guò)1％的脂肪酸有5種:LA（33.44％±3.45％）、OA(32.66％±1.78％)、ALA(26.79％±2.75％)、PA（5.1％±0.84％）和SA(1.44％±0.87％)。
　　同時(shí)，對(duì)9個(gè)品種不同發(fā)育時(shí)期脂肪酸含量的變化進(jìn)行了分析，在‘PL1’種子發(fā)育過(guò)程中，籽油中ALA的相對(duì)含量不斷下降，S1時(shí)期時(shí)為最大值（43.76％±6.87％），S4時(shí)期下降到最低值（34.49％±1

5、.53％）。與之相反，OA的相對(duì)含量不斷升高，S1時(shí)期為20.70％±0.21％，在S4時(shí)期達(dá)到最高值30.01％±0.48％，LA的相對(duì)含量也基本呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，只是在S3時(shí)期稍有下降，從S1時(shí)期的28.35％±8.49％逐漸增加到S4時(shí)期的30.13％±1.53％。其他8個(gè)芍藥品種籽油中的脂肪酸均呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)。
　　(2)以‘杭芍’種子中所提取的RNA為模板，根據(jù)Genbank中其他植物已登陸的相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)引物，克隆了芍

6、藥種子中與ALA生物合成相關(guān)的7個(gè)基因（PlSAD、 PlFAD2-1PlFAD2-2、PlAD3-1、PlFAD3-2、 PlFAD6和PlFA7），其cDNA全長(zhǎng)分別為1570bp、1452bp、1466bp、865bp、1685bp、1417bp和1782bp，相應(yīng)地編碼395、383、384、281、435、409、和448個(gè)氨基酸，且其編碼的氨基酸序列與其他植物存在較高的的一致性和相似性。基因登錄號(hào)分別為KJ441080、KJ

7、441081、KP271029、KR605462、KM575841、KP271030和KP271031。
　　(3)通過(guò)對(duì)9個(gè)芍藥品種籽油的脂肪酸進(jìn)行分析，篩選出ALA含量差異最顯著的兩個(gè)品種‘PL1’和‘PL2’，‘PL1’籽油中ALA含量最高(34.49％±1.53％)，‘PL2’籽油中ALA含量最低(20.08％±1.22％)。同時(shí)，通過(guò)Q-PCR技術(shù)分析了兩個(gè)品種（‘PL1’和‘PL2’）種子4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期PlSAD、P

8、IFAD2-1、PIFAD2-2、PlAD3-1、PlFAD3-2、PlFAD6和PlFAD7共7個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，7個(gè)相關(guān)基因在種子中均能被檢測(cè)到，且各個(gè)基因表達(dá)結(jié)果與脂肪酸含量變化趨勢(shì)較為一致，ALA含量相對(duì)較高的‘PL1’品種的基因表達(dá)普遍高于ALA含量相對(duì)較低的‘PL2’品種。其中，導(dǎo)致ALA積累水平不同而使‘PL1’和‘PL2’兩個(gè)芍藥品種ALA差異的關(guān)鍵基因是合成途徑中上游的PlSAD、PIFAD2-2和PIF