內質網居民糖蛋白KDELC1克隆表達及初步功能研究.pdf

1、目的：
　　 1.構建糖基轉移酶KDELC1新基因的原核表達載體，誘導融合蛋白表達，并對其進行純化，制備融合蛋白多克隆抗體。
　　 2.明確該糖基轉移酶在肝細胞內的表達定位及組織分布。
　　 3.探討KDELC1表達變化對HepG2細胞周期可能的調節(jié)作用。
　　 4.探討內質網應激過程中該蛋白表達變化特征。
　　 5.探討該蛋白在肝細胞損傷中的調節(jié)作用。
　　 方法：
　　 1.克

2、隆、表達KDELC1融合蛋白。
　　 應用逆轉錄聚合酶鏈反應（Reverse transcription PCR，RT-PCR）技術，以人肝母細胞瘤細胞系（HepG2細胞）為模板提取總RNA，反轉錄cDNA，擴增目的基因KDELC1的全長CDs，并將其克隆至pGEM-T-EASY載體，測序驗證。隨后將KDELC1全長片段插入原核表達載體pET-32a（+）中，轉化大腸桿菌E.coli BL21（DE3），IPTG誘導融合蛋白表達

3、，分別通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法和免疫印跡（Western blot）法，分析驗證融合蛋白表達的特異性。隨后大量誘導該蛋白表達，利用親和層析法對表達蛋白進行純化。
　　 2.制備KDELC1的多克隆抗體。
　　 以純化的融合蛋白為抗原，免疫新西蘭大白兔，獲得多克隆抗體。同時以免疫前后的兔血清作為一抗，利用Western blot技術和ELISA方法對多克隆抗體進行特異性分析和效價檢測。
　　 3

4、.構建KDELC1細胞內定位載體。
　　 擴增KDELC1全長CDs，將全長片段插入至綠色熒光蛋白真核表達載體pEGFP-C1中，分別用雙酶切、測序進行鑒定，從而構建KDELCl與綠色熒光蛋白基因真核共表達質粒pEGFP-C1-KDELC1。隨后利用已構建的內質網居民蛋白calreticulin定位質粒pERFP-calrrticulin-N1，共轉染HepG2細胞后，利用激光共聚焦顯微術，觀察分析KDELC1在細胞內的分布特征

5、。
　　 4.分析KDELC1在組織中的分布特征。
　　 利用上述制備成功的KDELC1多克隆抗體，采用免疫組織化學技術，觀察分析KDELC1在肝臟、肺、腎臟、脾臟、胃、乳腺、淋巴結、直腸組織中的分布特征。
　　 5.構建、篩選KDELC1干擾質粒。
　　 委托Inventrogen公司，構建KDELC1干擾質粒。將多對KDELC1干擾質粒轉染HepG2細胞，48小時后收獲細胞，提取總RNA并逆轉錄，通過

6、實時熒光定量PCR（real-time PCR）技術篩選出有效序列（pcDNA6.2-GW/EMG-FP mir-KDELC1 shRNA）。
　　 6.分析KDELC1表達變化對細胞周期的影響。
　　 分別利用pEGFP-C1-KDELC1和pcDNA6.2-GW/EMGFPmir-KDELC1-shRNA載體，轉染HepG2細胞，調節(jié)KDELC1的表達，利用流式細胞儀分析KDELC1高表達和低表達對細胞周期的影響。<

7、br>　　 7.初步探討KDELC1在內質網應激中的作用。
　　 利用衣霉素刺激HepG2細胞，建立細胞內質網應激模型。分別利用Western blot、real-time PCR法，檢測內質網應激過程中KDELC1蛋白水平和mRNA水平的表達變化情況。
　　 8.初步探討KDELC1在臨床肝損傷中的作用。
　　 收集臨床肝功能異常血清標本及正常對照血清標本，利用ELISA技術包被酶標板，采用上述制備的KDEL

8、C1多克隆抗體，分析該蛋白在肝損傷過程中可能的變化情況。
　　 結果：
　　 1.成功獲得KDELC1融合蛋白。
　　 人肝母細胞瘤細胞系HepG2經10％小牛血清DMEM培養(yǎng)36h后，Trizol法從HepG2細胞中提取總RNA。經RT-PCR擴增獲得HepG2細胞cDNA。成功構建KDELC1的原核表達載體pET32a（+）-KDELC1，轉化大腸桿菌E.coli BL21表達菌，經多次實驗驗證，確認終濃度為

9、1mmol/L的IPTG、30℃、4h可誘導表達出KDELC1融合蛋白，經SDS-PAGE和Western blot檢測確認。
　　 2.成功獲得KDELC1的多克隆抗體。
　　 利用親和層析柱，使用終濃度為10mM咪唑的結合緩沖液，依次加50％，100％終濃度為150mM的咪唑結合緩沖液，50％，100％的500m M咪唑結合緩沖液洗脫層析柱，得到KDELC1的融合蛋白，經Western blot、SDS-PAGE驗證

10、。將所得KDELC1融合蛋白免疫新西蘭大白兔5次，取其血清，使用蛋白A瓊脂糖層析柱純化KDELC1多克隆抗體，經Western blot檢測證明該抗體有較好的特異性。
　　 3.成功構建KDELC1的細胞內定位載體。
　　 分別構建真核表達質粒pEGFP-C1-KDELC1、pERFP-calrrticulin-N1，經雙酶切、測序鑒定后，共轉染HepG2細胞。激光共聚焦顯示pEGFP-C1-KDELC1與內質網居民蛋白

11、calreticulin存在共定位現象。
　　 4.初步了解KDELC1在組織中的分布特征。
　　 利用免疫組織化學技術發(fā)現，KDELC1高表達于肝組織，弱表達于其他組織。胃、直腸以及喉組織較少表達；弱表達于腎小管，腎小球及系膜組織表達較弱。肺組織中度表達；淋巴結及脾臟高表達，主要表達于生發(fā)中心周圍較成熟的淋巴細胞。
　　 5.成功構建、篩選出KDELC1的干擾質粒。
　　 通過實時熒光定量PCR（rea

12、l-time PCR）技術成功篩選出shRNA干擾質粒pcDNA6.2-GW/EMGFPmir-KDELC1 shRNA（pcDNA6.2-KDELC1 shRNA）。
　　 6.KDELC1的表達變化參與調節(jié)細胞周期。
　　 流式細胞儀結果顯示KDELC1表達質粒pEGFP-C1-KDELC1轉染后的HepG2細胞S期顯著顯著增加；而轉染KDELC1 RNA干擾質粒pcDNA6.2-KDEL C1-RNAi-1后S期顯

13、著降低。
　　 7.KDELC1與內質網應激有關。
　　 在衣霉素誘導的內質網應激過程中，KDELC1在蛋白水平和mRNA水平表達基本一致，不同濃度的藥物組之間蛋白表達無明顯變化，但與非藥物組相比，KDELC1的表達有較高程度的上調。
　　 8.KDELC1與臨床肝損傷有關
　　 通過ELISA技術分析，結果表明KDELC1蛋白在肝功能異常組較正常組表達明顯增高。
　　 結論：
　　 1.

14、KDELC1原核表達融合蛋白分子量75kDa，免疫動物制備的KEDLC1的蛋白多克隆抗體具有較高的KEDLC1結合活性。
　　 2.KEDLC1與內質網居民蛋白calreticulin蛋白存在共定位關系，提示KEDLC1定位于內質網。
　　 3.KEDLC1在肝臟、肺、腎臟、脾臟、胃、乳腺、淋巴結、直腸組織中均有表達。
　　 4.KEDLC1參與調控細胞周期，高表達促進細胞增殖，低表達抑制細.胞增殖。