大鼠胰島β細(xì)胞P糖蛋白的表達(dá)及功能研究.pdf

1、目的：早期研究顯示在小鼠胰島B細(xì)胞中有一種與P糖蛋白（也稱為多藥耐藥蛋白1，Multidrug Resistantance Protein1，MDR1）相似的65kDa大小的膜蛋白，且借助膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)此蛋白有類似磺脲類受體的功能，可促進(jìn)胰島素顆粒釋放。本課題目的首先探測(cè)大鼠胰島B細(xì)胞中mini-P糖蛋白存在的可能性，并使用拮抗劑及RNA干擾技術(shù)進(jìn)行該蛋白的功能研究，分析其在胰島素兩相分泌中的作用。
　　 方法：（1）經(jīng)膽管不離

2、體灌注膠原酶V消化分離Wistar大鼠胰島；INS-1細(xì)胞培養(yǎng)。分別提取大鼠胰島、胰腺及INS-1細(xì)胞中的總RNA，針對(duì)MDR1特異基因序列abcbIb的3’末端及5’末端設(shè)計(jì)多對(duì)引物，進(jìn)行RT-PCR；萃取大鼠胰島及INS-1細(xì)胞蛋白，以MDR1特異性抗體（C219）進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，探測(cè)目的蛋白的存在。（2）針對(duì)P糖蛋白特異基因序列（abcbIb）設(shè)計(jì)寡核苷酸序列，使用siRNA干擾技術(shù)孵育胰島；轉(zhuǎn)染效率的觀察分別采用熒光顯微鏡觀察

3、，real-time PCR法測(cè)定目的基因的表達(dá)量及Western Blot法測(cè)定蛋白表達(dá)量的變化；進(jìn)行葡萄糖刺激的胰島素釋放實(shí)驗(yàn)，采用放免法測(cè)定RNA干擾后大鼠胰島的胰島素兩相分泌的變化。（3）建立高糖培養(yǎng)大鼠胰島凋亡的模型，采用real-time PCR法測(cè)定siRNA干擾后，凋亡基因表達(dá)的變化，評(píng)價(jià)RNA干擾對(duì)于胰島凋亡的影響，進(jìn)一步分析目的蛋白在胰島素兩相分泌中的作用。（4）使用MDR1特異性拮抗劑（環(huán)孢菌素A）干預(yù)大鼠胰島，放

4、免法測(cè)定胰島素的兩相分泌。
　　 結(jié)果：（1）RT-PCR實(shí)驗(yàn)提取的大鼠胰島、胰腺及INS-1細(xì)胞中均擴(kuò)增出了相應(yīng)的目的片段，且在胰島中的表達(dá)量較胰腺及INS-1細(xì)胞中表達(dá)量大。免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，使用C219在胰島勻漿蛋白中探測(cè)到65kDa大小的蛋白，在INS-1細(xì)胞蛋白萃取液中探測(cè)到了160kDa大小的蛋白。（2）在RNA干擾實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的胰島于熒光顯微鏡下觀察可見90％的胰島均呈現(xiàn)紅色熒光，提示轉(zhuǎn)染成功；Wester

5、n Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在空白組、實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組，使用C219均探測(cè)到了65kDa大小的蛋白，且實(shí)驗(yàn)組較空白組及陰性對(duì)照組蛋白表達(dá)量下調(diào)，而空白組及陰性對(duì)照無明顯變化；siRNA干擾后abcbI6基因的表達(dá)量實(shí)驗(yàn)組的較陰性及空白組減少，陰性組及空白組兩組無變化；與abcbIb基因相似的abcbIa基因的表達(dá)量在三組中無變化，胰島素合成相關(guān)基因insuin1、insulin2及胰高血糖素合成基因glucagon表達(dá)量無變化；siRNA

6、干擾后，三組胰島素分泌均呈現(xiàn)兩相分泌，實(shí)驗(yàn)組的胰島素一相及二相分泌較空白組及陰性對(duì)照組均受損。（3）高糖孵育后高糖組casp3及bax基因的表達(dá)量較正常組上調(diào)，高糖組Bcl-2基因的表達(dá)量較正常組下調(diào)，而Bcl-xl基因在兩組中表達(dá)無差異；siRNA干擾后casp3 bax Bcl-2及Bcl-xl基因表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白組中的表達(dá)量均無變化。（4）在體外胰島刺激實(shí)驗(yàn)中，MDR1拮抗劑環(huán)孢菌素A，抑制了胰島素第二時(shí)相分泌，但

7、胰島素第一時(shí)相分泌無明顯變化。
　　 結(jié)論：（1）在INS-1細(xì)胞中有全長(zhǎng)的P糖蛋白的表達(dá)，在大鼠胰島中有mini-P糖蛋白的表達(dá)。P糖蛋白的表達(dá)不同，提示著二者可能具有不同的生物學(xué)功能。在INS-1細(xì)胞中，P糖蛋白可能主要與耐藥相關(guān)，而在胰島細(xì)胞中，mini的P糖蛋白可能主要與胰島素的分泌釋放相關(guān)。（2）siRNA干擾后，目的基因abcbIb表達(dá)量下調(diào)，胰島素的兩相分泌均受損，而凋亡相關(guān)基因及胰島素合成相關(guān)基因的表達(dá)無改變，提

8、示siRNA干擾后未直接影響胰島素的合成，且胰島素的兩相分泌受損并非通過凋亡途徑，進(jìn)一步支持了前述觀點(diǎn)，P糖蛋白或mini-P糖蛋白影響胰島素顆粒的酸化成熟，調(diào)節(jié)胰島素的兩相分泌。（3）使用環(huán)孢菌素A干預(yù)胰島后，胰島素的一相分泌未受影響，而胰島素的二相分泌明顯受抑制，推測(cè)其拮抗P糖蛋白或mini-P糖蛋白，從而影響胰島素顆粒的酸化成熟，表現(xiàn)為胰島素的二相分泌受損。（4）深入研究mini-P糖蛋白的結(jié)構(gòu)及功能，可為新的降糖藥物的研發(fā)提供理