蛋白酶復(fù)合體抑制減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糖蛋白質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)組分及其在帕金森病中的研究.pdf

1、目的:
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)主要的降解途徑之一，廣泛參與了應(yīng)激反應(yīng)、細胞周期、凋亡及細胞信號傳導(dǎo)、離子通道調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)分泌在內(nèi)的調(diào)節(jié)過程。在阿爾茲海默癥、帕金森病、肌肉側(cè)索硬化癥等神經(jīng)退行性疾病中，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)受到抑制在疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮了一定的作用。鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)/鈣聯(lián)接蛋白(calnexin)(CRT/CNX)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的糖蛋白折疊監(jiān)控系統(tǒng)，正確折疊的蛋白質(zhì)留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

2、中或轉(zhuǎn)運到相應(yīng)的細胞器或胞外;輕度或中度錯誤折疊的蛋白質(zhì)在CRT/CNX質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)的協(xié)助下重新折疊;高度錯誤折疊而無法修復(fù)的蛋白質(zhì)被逆轉(zhuǎn)運到胞漿中被蛋白酶復(fù)合體降解，泛素-蛋白酶復(fù)合體失活和CRT/CNX糖蛋白質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)功能紊亂將導(dǎo)致死亡或發(fā)育延遲。本課題主要研究在神經(jīng)元損傷早期，蛋白酶復(fù)合體抑制情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糖蛋白質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)的改變，以及其改變機制，并在帕金森氏動物模型中研究蛋白酶復(fù)合體抑制對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)的調(diào)控
　　方

3、法：
　　1.蛋白酶體活性檢測實驗
　　取孕18天SD-大鼠胚胎，分離皮質(zhì)及黑質(zhì)區(qū)組織進行原代神經(jīng)元培養(yǎng)，7天后用非變性細胞裂解液裂解細胞，提取蛋白。將提取的蛋白質(zhì)和蛋白酶復(fù)合體酶切底物L(fēng)LVY-AMC共同孵育，蛋白酶復(fù)合體在糜蛋白酶切割作用下產(chǎn)生AMC，在Ex380nm、Em440nm下檢測熒光值，熒光值和蛋白質(zhì)的比值表示蛋白酶體復(fù)合體的活性。
　　2.細胞毒性試驗
　　將CRT穩(wěn)定knockdown的SH-S

4、Y5Y細胞用不同濃度6-羥基多巴胺處理24小時后，加MTS檢測吸光度，MTS是四唑類化合物，可被活細胞的線粒體內(nèi)多種脫氫酶還原成橙黃色的formazan，從而反應(yīng)細胞活力。
　　3.用ELISA檢測經(jīng)不同濃度蛋白酶體抑制劑處理的皮質(zhì)及黑質(zhì)區(qū)原代神經(jīng)細胞上清中分泌的calreticulin。
　　4.Western blot檢測蛋白酶復(fù)合體抑制劑處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)CRT/CNX組分calreticulin

5、，calnexin，ERp57的表達變化。
　　5.用立體定位儀向SD-大鼠單側(cè)紋狀體定位注射6-羥基多巴胺建立帕金森氏病動物模型，提取大鼠雙側(cè)皮質(zhì)、紋狀體、中腦蛋白質(zhì)，對比檢測calreticulin，calnexin，ERp57和GRP78的變化，并做免疫組化分析相應(yīng)蛋白質(zhì)的改變。
　　結(jié)果：
　　1.在神經(jīng)元未發(fā)生凋亡的前提下，1um蛋白酶復(fù)合體抑制劑處理原代神經(jīng)元后，CRT、ERp57的蛋白水平下降，而CRT/

6、CNX質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)的calnexin及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中另一分子伴侶GRP78蛋白水平?jīng)]有改變;在蛋白酶復(fù)合體抑制劑處理神經(jīng)元的上清中檢測到CRT含量增加，當(dāng)加入抑制蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運的特異性蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑Brefeldin A后，這種變化受到抑制。
　　2.在多巴胺能神經(jīng)元細胞系SH-SY5Y中穩(wěn)定knockdown CRT，增加了SH-SY5Y對多巴胺能神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺的毒性敏感性。
　　3.在帕金森動物模型中，6

7、-羥基多巴胺注射側(cè)黑質(zhì)區(qū)CRT和ERp57表達與對照側(cè)相比顯著下降，而GRP78和calnexin沒有變化;同時黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細胞的蛋白酶復(fù)合體活性較對側(cè)明顯降低，雙側(cè)大腦皮質(zhì)、紋狀體中CRT、ERp57、CNX、GRP78對比沒有差異，蛋白酶復(fù)合體活性也沒有改變。
　　結(jié)論：
　　蛋白酶復(fù)合體抑制在不引起神經(jīng)元凋亡的前提下，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)CRT/CNX質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)蛋白質(zhì)組分CRT，ERp57的蛋白質(zhì)含量，CRT的減少是由于蛋白酶