Bardet-BiedL綜合征蛋白質復合體BBSome在蛋白-蛋白相互作用調節(jié)及分子伴侶復合輔助下的組裝.pdf

1、目的：
　　 纖毛(cilium/cilia)是從一些原核細胞和真核細胞表面伸出的突起，由三個主要部分組成:中央軸絲、圍繞它的質膜和一些細胞質。纖毛在脊椎動物體內的廣泛存在可以解釋當其結構或功能出現(xiàn)障礙時出現(xiàn)的復雜多樣的疾病或表型。目前已知存在纖毛功能不全的有腎、視網膜組織以及神經管、發(fā)育中的肢體、胰腺、肝臟、脾、骨骼及中樞神經系統(tǒng)的一些部分。這些疾病因病因學及遺傳學方面的重疊而被歸入一個大類，統(tǒng)稱為纖毛相關疾病(Ciliopa

2、thies)。日前的研究數(shù)據可幫助我們在這類疾病中發(fā)現(xiàn)新的基因突變，另外在認識纖毛相關疾病的癥狀方面也大有幫助。
　　 Bardet-Biedl綜合征（Bardet-Biedl syndrome，BBS）是一種罕見的與纖毛相關的人類常染色體隱性遺傳疾病，影響人體多個系統(tǒng)。其主要臨床癥狀包括肥胖、視網膜色素變性、多指（趾）畸形、多囊腎、性腺發(fā)育不全、認知障礙、高血壓及糖尿病等等。由于其多樣的臨床癥狀，使Bardet-Biedl綜合

3、征成為研究多種人類疾病分子機制的重要模型。到日前為止，共有16個BBS基因被報導，其中BBS1、2、4、5、7、8和9七種所編碼的蛋白共同構成Bardet-Biedl綜合征蛋白復合體BBSome。
　　 人們對BBSome組裝過程的步驟、調節(jié)知之甚少。在體內，幾乎所有的構成BBSome的蛋白都以BBSome復合體亞基形式存在，而極少見游離分子，這提示BBSome的組裝過程進行的非常迅速，且各中間體存在時間極短。本研究對BBSom

4、e復合體組裝的全過程進行了深入研究，嘗試建立一個BBSome組裝的模型。對BBSome組裝過程的研究將給各亞基的功能研究奠定基礎，并給BBSome的整體功能研究提供新的思路。
　　 材料及方法：
　　 1、克隆及亞克隆使用的菌株、載體、工具酶等
　　 大腸桿菌DH5α，克隆載體PSTBlue、 StrataClone，表達載體pCS2(+)-3xFlag、pCS2(+)-HA、 pCS2(+)-mycs、 pEG

5、FP-N3/C3; Expand HiFi、Expand Long TemplateDNA合成酶;所有限制性內切酶（包括部分高保真版本）、T4 DNA連接酶、Klenow等來自NEB。所有點突變型質粒均使用QuickChangeⅡ site-directedmutagenesis試劑盒構建并經測序確認。所有相關人類及小鼠基因cDNA序列信息來自UCSC Genome Browser數(shù)據庫，使用APE共享版軟件及Sequencher4.8

6、進行序列分析、內切酶選擇、引物設計及測序結果對比篩選。
　　 2、本研究中應用的抗體
　　 兔抗人多克隆抗體BBS1、2、4、7，單克隆抗體anti-β-tubulin，多克隆抗體anti-β-actin，單克隆抗體anti-acetylated tubulin，單克隆抗體anti-γ-tubulin，兔抗人單克隆抗體anti-BBS8、9， thermolysin， and cycloheximide。羊anti-BB

7、S2(C-16)。大鼠anti-TCP1a and TCP1b。兔anti-ubiquitin。 Smartpool RNAi against humanBBS2, BBS10, BBS12, BBS9。
　　 3、細胞培養(yǎng)及轉染
　　 本研究使用的皮膚成纖維細胞取自(一)攜帶BBS10常見突變c91fs95的人類Bardet-Biedl綜合征患者;另使用293T細胞及hTERT-RPE1細胞。轉染使用lipofecta

8、mine2000或RNAiMAX。
　　 4、免疫熒光觀察目的蛋白定位
　　 細胞以冷甲醇與固定后PBS洗滌封閉;封閉液中稀釋日的蛋白標簽—抗在窒溫孵育后PBS洗滌;再次封閉，后以Alexa488或Alexa568標記的二抗孵育。最終以Vectashield mounting media containing DAPI裱片，并在熒光共焦顯微鏡下觀察并拍攝。
　　 5、免疫共沉淀觀察各蛋白質分子間相互作用
　

9、　 使用不同標簽的人類BBS基因被共轉染入293T細胞。轉染48小時后，裂解細胞、離心。取上清以protein G beads孵育。經孵育后的細胞裂解液再以標記有相應抗體的beads孵育，以裂解液洗滌后行Western Blot并以相應抗體檢測。
　　 6、Western Blot檢測蛋白表達水平
　　 取野生型及突變型雄性小鼠睪丸制備組織勻漿，Nanodrop蛋白定量。蛋白經電泳分離、電轉至硝酸纖維素并以SuperS

10、ignal Dura extended substrate發(fā)光檢測。
　　 7、蔗糖密度梯度離心
　　 小鼠組織制備組織勻漿，離心，上清轉移至20-60％蔗糖梯度離心液，超速離心。取上清液并以冷丙酮沉淀，離心。沉淀以SDS-PAGE上樣緩沖液溶解并以Western Blot檢測。
　　 8、蛋白酶敏感性實驗觀察蛋白質穩(wěn)定性及降解情況
　　 以分析液裂解細胞，等量蛋白與therolysin混合。終止反應后W

11、estern Blot檢測，觀察泛素化蛋白質降解途徑下BBS蛋白的降解情況。
　　 9、小鼠
　　 本研究中應用了多個Bbs基因knock-in或knock-out小鼠。
　　 結果：
　　 1、BBS2、7、9首先形成一個三元亞復合體
　　 BBS2、7、9之間存在較強的相互作用，這種作用強于這三種蛋白與其他BBSome組分蛋白。該三元亞復合體成為整個BBSome的核心及其他亞基蛋白組裝進入BB

12、Some的平臺。
　　 2、BBS1及BBS4最后裝配入BBSome
　　 BBS1的最常見錯意突變型蛋白M390R并不影響除BBS4之外BBSome其他亞基組裝進入復合體，所有BBSome亞基蛋白中BBS1及BBS4最后裝配入BBSome，BBS4的整合則依賴于BBS1的存在。
　　 3、BBS4的定位
　　 BBS4與PCM1的結合及定位于中心體/中心粒周圍衛(wèi)星體的過程不依賴于BBSome其它亞基，說

13、明這一定位是BBS4分子的固有屬性。
　　 4、BBS10的調節(jié)作用
　　 BBS10調節(jié)BBS7/12/6亞復合物及CCT/TRiC復合體之間的相互作用，且在整個BBSome的組裝過程和功能調節(jié)中發(fā)揮重要作用。
　　 5、BBS7的釋放
　　 BBS7從BBS分子伴侶復合體中釋放后參與形成BBS7/2/9的三元亞復合物。BBS9整合入BBSome是與CCT/TRiC復合體脫離BBS2/BBS7的過程相藕

14、連的。
　　 6、BBS2的穩(wěn)定性
　　 BBS2的穩(wěn)定性依賴于BBS2/BBS7/BBS9亞復合物、分子伴侶BBS蛋白及CCT/TRiC復合體。游離狀態(tài)下的BBS2最終進入泛素化途徑被蛋白酶體降解。
　　 結論：
　　 BBS2、7、9首先在BBS分子伴侶復合體的輔助下形成BBSome的核心三元復合體，而后BBSome的其他組分蛋白BBS1、5、8分別獨立整合入BBSome，最后BBS4依賴于BBS1的