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文檔簡介
1、細(xì)胞是生命的基本單位,而線粒體是細(xì)胞的重要的產(chǎn)能單位,它通過氧化磷酸化合成ATP,為細(xì)胞生命活動提供能量。植物線粒體中具有多種交替途徑所介導(dǎo)的能量耗散系統(tǒng),主要包括末端交替氧化途徑,解偶聯(lián)途徑和交替型NAD(P)H脫氫途徑。交替型NAD(P)H脫氡途徑由一類交替型NAD(P)H脫氧酶催化,能夠催化電子沿電子傳遞鏈傳遞給O2,但是不伴隨質(zhì)子跨膜梯度形成和ATP產(chǎn)生,因其不能被魚藤酮所抑制,又被稱為魚藤酮非敏感性NAD(P)H脫氫酶。近年來
2、在分離交替型NAD(P)H脫氫酶方面取得了很多進(jìn)展。對于蛋白質(zhì)的研究近年宋又成為焦點(diǎn),在蛋白質(zhì)復(fù)合體水平上的研究,不僅可以揭示未知功能蛋白的功能,還可以在探索己知蛋白在不同復(fù)合體中的新的功能。本論文以模式植物擬南芥為研究對象,從擬南芥線粒體可溶性部分中分離到一種具有類似于交替型NAD(P)H脫氫酶活性的復(fù)合體。通過質(zhì)譜鑒定和蛋白質(zhì)復(fù)合體研究手段確定了該復(fù)合體中蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用。取得了以下研究結(jié)果:
1.利用Nativ
3、e-PAGE從擬南芥線粒體可溶性部分中分離得到一個(gè)具有交替型NAD(P)H脫氫酶活性的復(fù)合體。利用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn),在這個(gè)復(fù)合體中除了硫辛酰胺脫氫酶LPD2以外,還存在兩個(gè)主要的亞基,N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸還原酶NAGPR和分子伴侶Cpn20,為擬南芥交替型NAD(P)H脫氫酶的研究作出了補(bǔ)充。
2.利用免疫共沉淀技術(shù)(co-IP)研究擬南芥NAD(P)H脫氫活性復(fù)合體中各亞基之間的相互作用關(guān)系。NAGPR
4、抗體免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)LPD2和Cpn20可以得到共純化,但是在LPD2抗體免疫共沉淀和Cpn20免疫共沉淀中只分別得到了Cpn20和LPD2,而沒有NAGPR被共沉淀。這些結(jié)果說明在這個(gè)類似交替型NAD(P)H脫氫酶復(fù)合體中,LPD2和Cpn20之間有直接相互作用,而LPD2,Cpn20和NAGPR的之間的相互作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
3.在煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行串聯(lián)親和純化實(shí)驗(yàn)。在煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中,LPD2-TAPa和NA
5、GPR-TAPa表達(dá)水平理想,說明重組的真核表達(dá)載體中目的基因沒有發(fā)生任何突變,而且實(shí)現(xiàn)了和串聯(lián)親和純化標(biāo)簽的融合表達(dá)。但是在煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中經(jīng)過串聯(lián)親和純化過程得到的LPD2-TAPa和NAGPR-TAPa復(fù)合體在western-blot中顯示出顯著的非特異性條帶,這說明煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)不適合用來進(jìn)行外源性蛋白復(fù)合體及外源性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的研究。
4.在擬南芥穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行串聯(lián)親和純化實(shí)驗(yàn),體內(nèi)分析LP
6、D2,Cpn20和NAGPR之間的相互作用關(guān)系。LPD2-ATPa的轉(zhuǎn)基囚擬南芥全蛋白經(jīng)過IgGBeads純化,SDS-PAGE分離和western-blot檢測,以TPAa-GFP為陰性對照,在LPD2-TAPa復(fù)合體中檢測到了Cpn20的存在,但是未檢測到NAGPR;在NAGPR-ATPa的轉(zhuǎn)基因擬南芥全蛋白經(jīng)過IgG Beads純化,SDS-PAGE分離和western-blot檢測,在NAGPR-TAPa復(fù)合體中未檢測到Cpn2
7、0的存在,同時(shí)通過TAPa-GFP陰性對照的對比,證實(shí)LPD2與NAGPR的結(jié)合為非特異性結(jié)合,兩者之間沒有特異性相互作用。
以上研究結(jié)果表明,在擬南芥線粒體可溶性部分中分離得到的具有交替型NAD(P)H脫氫酶活性的復(fù)合體中,Cpn20作為復(fù)合體亞基,和亞基LPD2之間存在特異性相互作用,它們結(jié)合在一起,存在于一個(gè)復(fù)合體中。這是首次揭示他們之間的相互作用。我們推測Cpn20可能協(xié)助LPD2進(jìn)入線粒體后正確折疊,此外,他們之
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