內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶Calnexin-Calreticulin輔助埃博拉病毒囊膜糖蛋白成熟機(jī)制的研究.pdf

1、埃博拉出血熱（Ebola Hemorrhagic Fever，EHF）是由埃博拉病毒引起的能夠感染人類及其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物的高度接觸性傳染病，其主要癥狀為高熱、出血，死亡率高達(dá)90％。埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)屬于絲狀病毒科絲狀病毒屬的成員，為單股、負(fù)鏈、有囊膜的RNA病毒。其表面的囊膜糖蛋白GP是高度糖基化的蛋白，在介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)等過程中起著關(guān)鍵性作用。
　　分子伴侶鈣連蛋白（CNX）

2、、鈣網(wǎng)蛋白（CRT）是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一類分子，能夠介導(dǎo)糖蛋白的加工和成熟過程。為了研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶 CNX、CRT輔助埃博拉病毒囊膜糖蛋白成熟的機(jī)制，本試驗(yàn)首先利用 CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了 CNX、CRT基因敲除的293T細(xì)胞系。將表達(dá)埃博拉病毒囊膜蛋白 GP mucin區(qū)域缺失基因(GP△MLD)的重組質(zhì)粒，與囊膜蛋白缺失、表達(dá)熒光素酶（Luc）的人免疫缺陷病病毒 I型（HIV-1）基因組的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞（2

3、93T），以包裝整合含有埃博拉病毒囊膜蛋白的偽型 EBOV病毒。在293T野生型（WT）、CNX KO、CRT KO、CNX/CRT D.KO的細(xì)胞中分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示在 CNX KO、CRT KO的細(xì)胞系上GP△MLD蛋白的表達(dá)量和偽型病毒的包裝效率與野生型細(xì)胞系相比有所降低，CNX/CRT D.KO細(xì)胞系上影響最為明顯。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示 CNX、CRT都會(huì)與Flag偶聯(lián)的GP△MLD發(fā)生相互作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CNX、CRT在

4、介導(dǎo)埃博拉病毒增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證CNX、CRT影響GP△MLD蛋白成熟的作用機(jī)制，我們通過點(diǎn)突變的方法將GP△MLD的9個(gè)N-鏈接的糖鏈分別缺失后，發(fā)現(xiàn)N563、N618兩點(diǎn)糖鏈的缺失使其在293T細(xì)胞中蛋白表達(dá)量有所下調(diào)，病毒組裝能力及感染力明顯降低。然后將糖鏈進(jìn)行進(jìn)一步 N-端依次缺失或者進(jìn)行組合缺失，結(jié)果顯示，N563、N618兩點(diǎn)糖鏈的同時(shí)缺失明顯影響了偽型病毒的組裝和感染效率。該結(jié)果提示 N5

5、63、N618兩點(diǎn)在維持 GP△MLD的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用。用Endo H酶消化處理蛋白裂解液，結(jié)果顯示N563、N618兩點(diǎn)糖鏈同時(shí)缺失的蛋白幾乎全部被Endo H酶消化，由于糖鏈被剪切蛋白分子量變小，而野生型的蛋白則會(huì)有GP1蛋白進(jìn)入高爾基體中從而不能被Endo H酶消化。結(jié)果表明N563、N618兩點(diǎn)糖鏈的缺失通過將未成熟的蛋白以 GP0的形式被阻滯在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中從而影響了蛋白的切割和進(jìn)一步的加工過程，進(jìn)而影響病毒蛋白的生物

6、學(xué)功能。更為有意思的是，IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， C-端的5個(gè)糖鏈缺失后的 GP△MLD與 CNX、CRT的相互作用明顯增強(qiáng)，而 N-端4個(gè)糖鏈缺失后的 GP△MLD與 CNX、CRT的相互作用信號(hào)較弱。該結(jié)果提示C-端的糖鏈在維持GP△MLD蛋白結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要作用，而 CNX、CRT通過在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中阻滯錯(cuò)誤折疊的 GP蛋白的運(yùn)輸以此參與調(diào)節(jié)蛋白的質(zhì)量控制系統(tǒng)。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論在含 mucin區(qū)域的全長(zhǎng) GP蛋白結(jié)構(gòu)中

7、的可行性，我們?cè)谌L(zhǎng) GP蛋白中驗(yàn)證上述結(jié)論。結(jié)果顯示在 CNX KO、CRT KO上蛋白表達(dá)和病毒組裝能力有所降低， CNX/CRT D.KO上降低最明顯。同時(shí)，N563、N618兩點(diǎn)糖鏈的缺失使GP蛋白的剪切效率明顯降低，病毒組裝能力和感染力減弱。
　　綜上所述，本課題主要對(duì) CNX、CRT在 GP蛋白糖基化修飾過程中的作用進(jìn)行相關(guān)研究，證明了分子伴侶 CNX、CRT與埃博拉病毒囊膜糖蛋白 GP存在相互作用，缺失會(huì)影響 GP的