全人源埃博拉病毒中和抗體的研究.pdf

1、扎伊爾型埃博拉病毒（EBOV）能在人類和非人靈長(zhǎng)類（NHPs）體內(nèi)引發(fā)急性嚴(yán)重出血熱病，具有極強(qiáng)的傳染性和致死率。2014年西非爆發(fā)的埃博拉疫情推進(jìn)了相關(guān)疫苗和抗病毒藥物的快速發(fā)展，但截止目前仍沒(méi)有獲批的預(yù)防或治療埃博拉病毒的藥物。埃博拉病毒的包膜糖蛋白（GP）在病毒入侵過(guò)程中扮演著關(guān)鍵的角色，是疫苗和抗體研究的重要靶標(biāo)。實(shí)驗(yàn)室前期自主研制的5型腺病毒載體的重組埃博拉疫苗已完成了 II期臨床試驗(yàn)，在人體中具有良好的安全性，并且可有效地激

2、發(fā)免疫反應(yīng)。由于疫苗需要在感染前使用才能達(dá)到保護(hù)效果，所以開展暴露后治療手段的研究很有必要，而單克隆抗體因其良好的特異性和藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，是目前免疫治療的研究熱點(diǎn)。本研究的目的是從疫苗臨床受試者體內(nèi)篩選具有埃博拉病毒中和活性的單克隆抗體，并對(duì)其結(jié)合表位和保護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究，為埃博拉病毒的暴露后治療提供有效的手段。
　　首先，基于流式分選和單細(xì)胞 PCR的抗體篩選平臺(tái)，從疫苗受試者血樣中篩選獲得了GP的結(jié)合抗體。利用人類免疫缺陷病毒骨

3、架的重組EBOV假病毒對(duì)不同受試者的血清進(jìn)行體外中和實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞感染的程度通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)水平來(lái)反映。各血清樣品對(duì)假病毒表現(xiàn)出不同程度的中和活性，選取中和活性較好的受試者血樣進(jìn)行了流式分選。根據(jù)選定的表面分子標(biāo)記策略，從外周血淋巴細(xì)胞中分離得到1920個(gè)抗體分泌細(xì)胞。然后通過(guò)單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄和巢式兩步PCR的方法，從單個(gè)抗體分泌細(xì)胞中擴(kuò)增并挑選出462對(duì)自然配對(duì)的抗體輕重鏈可變區(qū)基因，陽(yáng)性率為24％。為了快速、高通量地表達(dá)抗體，將配

4、對(duì)的抗體輕重鏈可變區(qū)基因分別構(gòu)建成輕重鏈全長(zhǎng)基因線性表達(dá)框，轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IgG含量及GP的結(jié)合活性，篩選得到32株GP結(jié)合陽(yáng)性的抗體，得率為6.93%。對(duì)結(jié)合抗體基因的同源性分析顯示這些抗體兩兩不同，其亞類分布與正常人體內(nèi)抗體的亞類分布一致。
　　其次，制備了四種截短型抗原，對(duì)純化抗體的結(jié)合特性進(jìn)行進(jìn)一步的分析。將抗體輕重鏈基因構(gòu)建至pcDNA3.4質(zhì)粒中，并在Expi293細(xì)胞中表達(dá)，

5、經(jīng)Protein A親和純化，成功獲得了純化的單克隆抗體。為了分析單抗的結(jié)合區(qū)域，設(shè)計(jì)構(gòu)建了四種截短型的 GP——GPecto、GPdmucin、sGP和 GP1。選擇分子量適中、在整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中最為重要的GPdmucin，分別在原核、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)和鑒定，以確定最佳的表達(dá)系統(tǒng)。結(jié)果顯示，原核系統(tǒng)表達(dá)的GPdmucin不穩(wěn)定，活性差；在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中，不溶性的 GPdmucin表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)；利用Expi293瞬時(shí)蛋白表達(dá)

6、系統(tǒng)，得到了可溶表達(dá)的GPdmucin，Ni柱親和層析獲得的目的蛋白純度達(dá)90%以上，且與特異抗體具有良好的結(jié)合活性。隨后對(duì)另外三種截短型的GP進(jìn)行了表達(dá)和純化。用以上抗原對(duì)純化單抗進(jìn)行了特異性及結(jié)合區(qū)域分析，17株單抗特異性良好，其中16株抗體能與四種截短型GP均發(fā)生結(jié)合，說(shuō)明這些抗體結(jié)合于四種截短型GP所共有的sGP區(qū)域；1株抗體17F3僅能與GPecto和GPdmucin結(jié)合，不能與sGP和GP1結(jié)合，推測(cè)其結(jié)合于GP2亞基。

7、r>　　再次，在體外和體內(nèi)對(duì)單抗的中和活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。采用HIV-EBOV GP和VSV-EBOV GP假病毒分別在HEK293和Vero細(xì)胞上進(jìn)行了中和實(shí)驗(yàn)，一株抗體1B3對(duì)兩種假病毒均表現(xiàn)出較好的中和能力。在加拿大公共衛(wèi)生局國(guó)家微生物實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染EBOV后第1天和第2天單獨(dú)給藥，1B3抗體可分別提供90%和60%的存活率，起到顯著的保護(hù)作用。1B3對(duì)EBOV良好的中和活性提示其是一株潛在的EBOV治療抗體

8、。絲狀病毒的GP之間有著較高的序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性，尤其是受體結(jié)合區(qū)更為保守，而1B3可能與保守性的受體結(jié)合區(qū)存在作用，用多種絲狀病毒的GP對(duì)1B3的廣譜結(jié)合活性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示1B3能夠與 BDBV GP交叉結(jié)合，但體外不能中和BDBV假病毒，說(shuō)明1B3在BDBV上的結(jié)合方式不同于EBOV。
　　最后，對(duì)1B3抗體的結(jié)合表位與中和機(jī)制進(jìn)行了研究。通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件Discovery Studio，對(duì)1B3和GP的結(jié)合方式進(jìn)行了

9、預(yù)測(cè)分析，得到兩者結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。構(gòu)建GP關(guān)鍵位點(diǎn)的丙氨酸突變株，利用pDisplay載體將其展示在細(xì)胞表面，通過(guò)Western Blot和流式分析進(jìn)行了驗(yàn)證。得到GP上的關(guān)鍵氨基酸為位于受體結(jié)合區(qū)兩端的117和118、171和172兩對(duì)相鄰的氨基酸，這些位點(diǎn)突變后GP與1B3的結(jié)合活性丟失。這四位氨基酸在絲狀病毒的受體結(jié)合區(qū)上是保守的，通過(guò)構(gòu)建突變株排除了該區(qū)域其他非保守氨基酸參與1B3結(jié)合的可能。但結(jié)合于sGP區(qū)域的1B3不能

10、與除了BDBV、EBOV以外的GP結(jié)合，提示聚糖帽上的一些位點(diǎn)可能參與了1B3的結(jié)合。借助已知結(jié)合表位的MIL77-1/-2/-3抗體，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)1B3的表位進(jìn)行了分析。1B3與結(jié)合于聚糖帽的 MIL77-3抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 GP，說(shuō)明二者的表位空間接近或存在交疊。為了研究1B3的保護(hù)機(jī)制，用嗜熱菌蛋白酶（thermolysin）體外酶切GPdmucin，切掉其上的聚糖帽，制備了激活態(tài)的GP（primed GP，GPcl）。同時(shí)，分

11、別在原核與哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中表達(dá)，制備了NPC1受體C結(jié)構(gòu)域蛋白（NPC1-C）。受體結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1B3對(duì)GPcl與NPC1-C的結(jié)合并未呈現(xiàn)出濃度依賴的抑制作用，說(shuō)明1B3不是通過(guò)阻斷GPcl與NPC1-C結(jié)合發(fā)揮保護(hù)作用的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)1B3與GPcl的結(jié)合活性丟失，說(shuō)明聚糖帽對(duì)于1B3與GP的結(jié)合密切相關(guān)，以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明1B3可能通過(guò)與受體結(jié)合區(qū)117、118、171和172位關(guān)鍵氨基酸及聚糖帽某些位點(diǎn)或糖基共同形成的表位作

12、用發(fā)揮保護(hù)活性。在酶切阻斷實(shí)驗(yàn)中，飽和結(jié)合1B3的GPdmucin仍可被thermolysin正常酶切，提示1B3不是通過(guò)阻斷酶切來(lái)發(fā)揮保護(hù)活性。
　　綜上所述，本研究從重組埃博拉疫苗臨床受試者體內(nèi)篩選獲得了多株GP特異的抗體，大部分的抗體結(jié)合于 sGP區(qū)域；在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中成功制備了不同的截短型GP，可用于 GP抗體分析、疫苗效果評(píng)價(jià)及病毒致病機(jī)理的相關(guān)研究；一株抗體1B3在細(xì)胞水平上和小鼠體內(nèi)均呈現(xiàn)出較好的中和活性，是有前