RT-LAMP檢測扎伊爾型埃博拉病毒的研究.pdf

1、埃博拉病毒(Ebola virus)作為烈性病原體之一，在2014年的暴發(fā)流行引起了全球的關(guān)注。埃博拉病毒是最早出現(xiàn)在1976年暴發(fā)于西非埃博拉河地區(qū)兩起疫情中，因此被命名為埃博拉。2014年，扎伊爾型埃博拉病毒病肆虐西非，其為自SARS以來最為嚴重的全球性公共衛(wèi)生事件。WHO判定此次西非埃博拉疫情是自1976年埃博拉病毒被發(fā)現(xiàn)以來暴發(fā)的范圍最廣且最復(fù)雜的埃博拉疫情，這次疫情出現(xiàn)的感染人數(shù)和死亡人數(shù)超出了其它全部疫情的總和。埃博拉病毒傳

2、播速度極快，首先出現(xiàn)在西非的幾內(nèi)亞共和國，后傳播至與其接壤的塞拉利昂和利比里亞，又由空中輸入尼日利亞和美國，然后蔓延到馬里和塞內(nèi)加爾。此次疫情在西非、歐洲和美洲等9個國家共造成了29000余人感染，11000余人死亡，引起了國際性的社會恐慌。美、英、法等國家及數(shù)個援助機構(gòu)、國際組織均投入巨額的人力、物力用以抵御西非疫情。我國也先后派出了包括移動式P3實驗室檢測隊、固定實驗室檢測隊、醫(yī)療隊在內(nèi)的數(shù)支救援力量用于幫助疫區(qū)國家和人民，并御疫情

3、于國門之外。
　　埃博拉病毒潛伏期為2-21天，早期癥狀和一般臨床實驗檢查指標缺乏特異性，而且在非洲地區(qū)有許多早期臨床癥狀相似的傳染病，如瘧疾、傷寒、黃熱病等。目前主要有依托ELISA法進行抗原抗體的檢測、活病毒培養(yǎng)電子顯微鏡下觀察和RT-PCR核酸檢測等方法對埃博拉病毒感染進行確診。但由于西非受疫情影響最重的幾個國家的衛(wèi)生系統(tǒng)并不健全，缺乏人力和基礎(chǔ)設(shè)施資源，對于需求昂貴精密儀器設(shè)備的現(xiàn)有檢測方法難以開展，急需要一種高效、使用方

4、便、不需要精密儀器設(shè)備的埃博拉病毒檢測方法。
　　LAMP是一種一步法核酸檢測技術(shù)。自LAMP出現(xiàn)以來，因其反應(yīng)時間短、操作便捷、不需要精密儀器等特點而成為核酸檢測和診斷領(lǐng)域研究的熱點，受到了WHO、學(xué)界和政府相關(guān)部門的廣泛關(guān)注，短短幾年，LAMP被廣泛應(yīng)用于各種病原體的檢測。LAMP技術(shù)的反應(yīng)原理是：根據(jù)目的基因設(shè)計的6條引物靶向性識別目的基因上的六個獨立片段，在Bst大片段聚合酶的作用下進行擴增反應(yīng)，大量擴增目標片段的同時也隨

5、之產(chǎn)生了大量沉淀(焦磷酸鎂)，反應(yīng)管濁度因此發(fā)生變化，因此可以通過實時濁度監(jiān)測來判斷反應(yīng)結(jié)果，還可以加入目視熒光染料進行目視檢測。LAMP在擴增過程中能靶向性識別目的基因的六個不同的基因片段，因此具有高特異性，并且整個實驗是在恒溫條件下進行，僅需要穩(wěn)定熱源就能可以進行反應(yīng)，不需要大型儀器設(shè)備。RT-LAMP技術(shù)是檢測RNA病毒的LAMP技術(shù)，在LAMP反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，能同時進行逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴增，這大大縮短了檢測RNA病毒的時間。

6、因其具有上述優(yōu)點，使之尤為適用于醫(yī)療衛(wèi)生條件較差的西非疫情一線，亦可用于缺少專業(yè)技術(shù)人才且檢測任務(wù)繁重的我國口岸檢疫機構(gòu)。
　　2014年西非埃博拉疫情歸根結(jié)底是扎伊爾型埃博拉病毒感染導(dǎo)致埃博拉病毒病引起的，雖然目前僅在非洲流行，但并不排除其傳播到其他大洲的可能性，因此快速檢測扎伊爾型埃博拉病毒尤為重要。埃博拉病毒生物安全等級為四級，在常規(guī)實驗條件下無法開展相關(guān)檢測工作。因此我們基于扎伊爾型埃博拉病毒NP蛋白的構(gòu)建了假病毒作為核酸

7、檢測的標準品，可代替扎伊爾型埃博拉活毒成為檢測靶標。這為扎伊爾型埃博拉病毒的核酸檢測方法的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　扎伊爾型埃博拉的NP基因是核衣殼的編碼基因，是一段高度保守的序列。針對扎伊爾型埃博拉的部分NP基因(633bp)設(shè)計5套引物，比較5套引物擴增效率得到最佳引物組合，并優(yōu)化了引物組合的濃度配比。我們采用2種檢測方法進行RT-LAMP即實時濁度儀監(jiān)測法和目視檢測法。兩種RT-LAMP檢測方法均能在61℃恒溫條件50mi

8、n內(nèi)完成反應(yīng)(最低檢出濃度均為4.56 copies/μl)，敏感性是RT-PCR的10倍(RT-PCR為45.6 copies/μl)。此外,我們還同時采用25種非埃博拉病毒和細菌進行特異性檢測，結(jié)果表明我們建立的RT-LAMP法對扎伊爾型埃博拉病毒具有極佳的特異性。另外，通過臨床模擬樣本實驗可以看出不同的臨床樣本中的雜質(zhì)對本方法的敏感性基本沒有影響，說明本方法對于樣本純度要求不高且具有良好的穩(wěn)定性，可應(yīng)用于基礎(chǔ)衛(wèi)生醫(yī)療條件較差的西非

9、各國和我國的基層檢測、檢疫機構(gòu)。
　　基于已建立的扎伊爾埃博拉檢測方法，我們聯(lián)合北京愛普益生物科技公司研制了扎伊爾型埃博拉病毒核酸檢測(RT-LAMP法)試劑盒。主要用于血液或咽拭子標本RNA中扎伊爾型埃博拉病毒的定性檢測，有利于該病毒的輔助診斷及流行病學(xué)檢測。該試劑盒具有高敏感性，最低檢測限達到1×103copies/ml，能耐受≦5天長途運輸，反復(fù)凍融≦6次性能穩(wěn)定。并被我國援助塞拉利昂實驗室第二批檢測隊帶到塞拉利昂，作為樣本

10、初篩的手段。經(jīng)過一定數(shù)量活毒樣本檢測，并與國際認可的熒光定量RT-PCR試劑盒檢測對比，證實了其具有高度的敏感性和特異性。
　　本研究以扎伊爾型埃博拉病毒部分 NP基因(633bp)為目的基因，基于RT-LAMP的2種檢測方法即實時濁度儀監(jiān)測法和目視檢測法建立了檢測扎伊爾型埃博拉病毒方法?；谀恳暀z測法組裝了4320人次的試劑盒，其具有可與金標準熒光定量RT-PCR方法基本一致的檢測效率，且具有操作簡單、無需精密儀器等優(yōu)點，可用于