rt-lamp技術(shù)檢測煙草環(huán)斑病毒的研究【開題報告】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文開題報告</b></p><p><b>　　食品質(zhì)量與安全</b></p><p>　　RT-LAMP技術(shù)檢測煙草環(huán)斑病毒的研究</p><p><b>　　選題的背景與意義</b></p><p>　　煙草環(huán)斑病毒（Tobacco ri

2、ngspot virus，TRSV）是中國進(jìn)境檢疫法規(guī)中明確規(guī)定禁止入境的危害性有害生物。該病毒寄主范圍廣，可侵染52科246種植物，是果樹、蔬菜、花卉等經(jīng)濟(jì)作物的重要病害之一，發(fā)生嚴(yán)重時可導(dǎo)致絕產(chǎn)。中國進(jìn)口的植物種球莖和苗木中攜帶該病毒的風(fēng)險很大。</p><p>　　國內(nèi)外針對TRSV所用的檢測技術(shù)主要有DAS-ELISA和RT-PCR技術(shù)。相比傳統(tǒng)的電鏡觀察和生物學(xué)鑒定，這2種方法在檢測周期方面具有明顯的優(yōu)

3、勢，操作快速簡便和高通量。但是，DAS-ELISA的檢測周期仍然需要6 h左右，且檢測靈敏度相對較低，假陽性較高；RT-PCR的整個檢測周期仍需4 h左右，且需要特殊的PCR擴(kuò)增設(shè)備、電泳設(shè)備和紫外成像設(shè)備，儀器昂貴，對人員技術(shù)能力要求較高，不利于技術(shù)向基層實驗室的推廣及現(xiàn)場檢疫。</p><p>　　環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Lamp-mediated isothermal amplification,LAMP）作為

4、一種新的核酸擴(kuò)增方法，依賴于能夠識別靶序列上6個特異區(qū)域的引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴(kuò)增的Bst DNA酶，在等溫條件下可高效、快速和特異地擴(kuò)增靶序列。該方法擴(kuò)增效率非常高，靈敏度高，特異性強(qiáng)，只要恒溫水浴鍋即可，擴(kuò)增結(jié)果加入熒光染料后可用肉眼直接觀察，無需特殊儀器，操作方便，對設(shè)備要求低，LAMP的整個反應(yīng)周期只需1.5~2.5 h，檢測周期非常短。</p><p>　　本研究的建立，將提供一種快速簡便檢測

5、煙草環(huán)斑病毒的方法，使該病毒乃至動植物種的其他病毒、細(xì)菌及真菌的基層實驗室檢測和現(xiàn)場檢疫成為可能。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p>　　本研究旨在建立用RT-LAMP技術(shù)檢測植物中的煙草環(huán)斑病毒的方法。整個研究內(nèi)容包括：(1)、設(shè)計RT-LAMP技術(shù)檢測煙草環(huán)斑病毒的引物序列；(2)、確定RT-LAMP技術(shù)檢測煙草環(huán)斑病毒的最佳溫度；(3)、確定

6、RT-LAMP技術(shù)檢測煙草環(huán)斑病毒的最佳反應(yīng)時間；(4)、檢驗本研究設(shè)計的引物在植物病毒檢驗中的特異性；(5)、比較常規(guī)的RT-PCR方法和本研究建立的方法檢測煙草環(huán)斑病毒的靈敏度；(6)、檢驗用熒光染料SYBR green I判斷實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性；(7)、檢驗本研究建立的方法在樣品檢驗中的應(yīng)用。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p>　　針對本研究的內(nèi)容設(shè)計研究

7、方法和技術(shù)路線如下：</p><p>　　(1)、查閱文獻(xiàn)，建立初步的煙草環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法；</p><p>　　(2)、根據(jù)GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中已登錄的煙草環(huán)斑病毒的外殼蛋白基因序列(D12477)，設(shè)計F3、B3、FIP（F1c＋TTTT+F2）、BIP（B1c＋TTTT＋B2）、Loop1和Loop2共6條引物；&

8、lt;/p><p>　　(3)、按照建立的煙草環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法，設(shè)置58℃、60℃、63℃、65℃四個反應(yīng)溫度進(jìn)行溫度優(yōu)化試驗；</p><p>　　(4)、按照建立的煙草環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法，在最佳溫度條件下，設(shè)置30 min、60 min、90 min三個反應(yīng)時間進(jìn)行時間優(yōu)化試驗；</p><p>　　(5)、用煙草環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病

9、毒、香石竹環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁病毒、番茄環(huán)斑病毒以及馬鈴薯V病毒等幾種常見的植物病毒RNA進(jìn)行特異性試驗；</p><p>　　(6)、用10－1、10－2、10－3、10－4和10－5稀釋的煙草環(huán)斑病毒RNA樣品為模板，用常規(guī)的RT-PCR方法和本研究建立的RT-LAMP方法進(jìn)行擴(kuò)增靈敏度比對試驗；</p><p>　　(7)、用凝膠電泳和熒光染料SYBR green I兩種方法判斷靈敏

10、度試驗中的RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，比較熒光染料SYBR green I判斷實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性；</p><p>　　(8)、用已用DAS-ELISA檢測呈TRSV陽性的進(jìn)境大豆樣品，采用本研究建立的RT-LAMP方法進(jìn)行擴(kuò)增檢測，結(jié)果采用SYBR green I染色觀察，檢驗該方法在樣品檢驗中的應(yīng)用。</p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　

11、　(1)、煙草環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法的初步建立。2010年12月15日至2010年12月25日。</p><p>　　(2)、RT-LAMP技術(shù)檢測煙草環(huán)斑病毒的引物序列的設(shè)計。2010年12月26日至2010年12月31日。</p><p>　　(3)、RT-LAMP技術(shù)檢測煙草環(huán)斑病毒的溫度優(yōu)化試驗。2011年1月3日至201年1月9日。</p><p&g

12、t;　　(4)、RT-LAMP技術(shù)檢測煙草環(huán)斑病毒的時間優(yōu)化試驗。2011年1月10日至2011年1月16日。</p><p>　　(5)、本研究設(shè)計的引物在植物病毒檢驗中的特異性檢驗試驗。2011年1月17日至2011年1月23日。</p><p>　　(6)、常規(guī)的RT-PCR方法和本研究建立的方法檢測煙草環(huán)斑病毒的靈敏度比較試驗；用熒光染料SYBR green I判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性試驗

13、。2011年2月21日至2011年3月6日。</p><p>　　(7)、本研究建立的方法在進(jìn)境大豆樣品檢驗中的應(yīng)用試驗。2011年3月7日至2011年3月11日。</p><p><b>　　主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 洪健，周雪平．ICTV第八次報告的最新植物病毒分類系統(tǒng)[J]．植物病理學(xué)報，2005，35（6）：1

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