應用RT-LAMP技術檢測腸道病毒Coxsackievirus A6的研究.pdf

1、目的:柯薩奇病毒A組6型病毒(coxsackievirus A6,CVA6)是引起手足口病的常見病原體,且其引起的手足口病常伴有甲病變等癥狀。本實驗的目的在于建立一種適于廣泛推廣的檢測CVA6的快速高效、靈敏特異的僅需在單個試管中一步完成的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增方法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),以滿足快速識別CVA6感染的需要。

2、
　　方法:采集手足口病病人的糞便樣本進行核酸擴增并鑒定分型后,選取合適標本用做反應模板。在GenBank上下載編碼CVA6衣殼蛋白VP1的基因序列,利用在線軟件設計針對CVA6基因組VP1片段保守區(qū)的引物,在特異性引物和具有鏈置換活性的Bst聚合酶作用下進行RT-LAMP反應,探索CVA6-RT-LAMP方法的最佳反應條件,肉眼觀察擴增結果或取產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析,驗證其特異性并與常規(guī)的逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse

3、transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)比較靈敏度。利用熒光PCR儀得到擴增產物的熔解曲線。
　　結果:優(yōu)化后的CVA6-RT-LAMP體系特異性強,僅能擴增出CVA6核酸,與其他型別的腸道病毒不發(fā)生非特異性擴增反應;靈敏度高,約為CVA6-RT-PCR法的100倍;反應快速,可在40分鐘內達到反應平臺期;熒光熔解曲線呈單峰狀,也說明反應產物單一,特異性強。
　　結論:本